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    本發明提供一種用於自第二型豬環狀病毒中回收藉由開放閱讀框架2表現之蛋白質的改良方法。該方法一般涉及以下步驟：將含有開放閱讀框架2編碼序列之重組病毒轉染至包含於生長培養基中之細胞中，引起該病毒表現開放閱讀框架2，及回收在上清液中之經表現之蛋白質。應在細胞感染大約5天之後開始進行此回收以容許足量重組蛋白質表現且自細胞分泌至生長培養基中。該等方法避免需要自細胞內分離及回收重組蛋白質之昂貴及費時的提取程序。
    公开号:TW201300531A
    申请号:TW101109225
    申请日:2005-12-29
    公开日:2013-01-01
    发明作者:馬克 艾奇梅爾；梅瑞爾 史恰菲爾；葛瑞格 尼瑟爾
    申请人:百靈佳殷格翰家畜藥品公司；
    IPC主号:A61K39-00
    专利说明:
    第二型豬環狀病毒(PCV2)免疫原組合物，及製備該組合物之方法
    本發明之一態樣係關於回收由第二型豬環狀病毒(PCV2)之開放閱讀框架2(ORF2)表現之蛋白質。更特定言之，該蛋白質係一種由轉染病毒表現之重組蛋白質，該病毒含有第二型豬環狀病毒開放閱讀框架2之重組編碼序列。更詳言之，該轉染病毒容許感染生長培養基中之細胞且由開放閱讀框架2表現之蛋白質係在上清液中而非自細胞內部回收。更詳言之，該方法涉及以下步驟：擴增來自第二型豬環狀病毒之開放閱讀框架2基因，將此經擴增之部分選殖至第一載體中，由此第一載體上切除開放閱讀框架2部分且將其選殖至一轉移載體中，用一病毒載體使該轉移載體共轉染至在生長培養基中之細胞中，引發該等細胞由該病毒載體感染且進而表現開放閱讀框架2，及在上清液中回收由開放閱讀框架2編碼的經表現之重組蛋白質。
    在另一態樣中，本發明係關於一種可有效引起對抗PCV2之免疫反應的免疫原組合物，及製備彼等免疫原組合物之方法。更特定言之，本發明係關於一種可有效提供一免疫反應之免疫組合物，該免疫反應保護接受該組合物之動物且減少或減輕與PCV2感染相關之臨床症狀之嚴重性。更詳細言之，本發明係關於一種基於蛋白質之免疫組合物，其對PCV2感染給予有效保護。更詳言之，本發明係關於一種包含PCV2之ORF2的免疫組合物，其中投予PCV2-ORF2造成對PCV2感染之保護。最詳言之，本發明係關於一種免疫組合物，其可有效地給與接受該免疫組合物之豬有效的免疫性，且其中該組合物包含由PCV2之ORF2表現之蛋白質。
    第二型豬環狀病毒(PCV2)係一小的(17-22 nm直徑)二十面體非包膜DNA病毒，其含有一單鏈環形基因組。PCV2與第一型豬環狀病毒(PCV1)共用大約80%序列一致性。然而，與一般為非毒力之PCV1相比，感染上PCV2之豬呈現一症候群，通常稱作離乳後多系統消耗性症候群(PMWS)。PMWS臨床特徵為消耗性、皮膚蒼白、羸弱、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸及黃疸病。在一些受感染豬中，將看到全部症狀之組合，而其它豬僅具有該等症狀中之一或兩種。在屍體解剖中，在多個組織及器官上亦可見到微觀及宏觀之損害，淋巴器官係損害最常見之部位。已觀察到在PCV2核酸或抗原數量與微觀淋巴損害嚴重性之間的強相關性。感染上PCV2的豬之死亡率可接近80%。除PMWS之外，PCV2已與若干其它感染相關，該等感染包括假狂犬病、豬繁殖及呼吸症候群(PRRS)、豬格雷舍氏病(Glasser's disease)、鏈球菌腦膜炎、沙門氏菌病、離乳後大腸桿菌病、飲食肝機能病及化膿性支氣管肺炎。
    PCV2之開放閱讀框架2(ORF2)蛋白質當在SDS-PAGE凝膠上檢測時，具有大約30 kDa之分子量，其過去已作為抗原組份用於PCV2之疫苗中。獲得用於該等疫苗中之ORF2之一般方法通常係由以下步驟組成：擴增為ORF2編碼之PCV2 DNA，用該ORF2 DNA轉染病毒載體，用含有該ORF2 DNA之病毒載體感染細胞，容許該病毒在細胞內表現ORF2蛋白質，及經由細胞溶解作用自細胞提取ORF2蛋白質。此等程序通常需要在病毒載體感染細胞之後至約四天的時間進行。然而，此等程序有一個缺點即提取程序既費錢且耗時。另外，自細胞中回收之ORF2量不是很高，因而需要藉由大量病毒載體感染大量細胞以獲得足量之重組表現蛋白質用於疫苗及其類似物。
    PCV2免疫之通用方法包括基於DNA之疫苗，諸如在美國專利第6,703,023號中描述之彼等疫苗。然而，該等疫苗在對抗PCV2感染及與此相關之臨床徵象給與保護性免疫上已經無效。
    因此，此項技術中需要的係一種不需要自受感染細胞內提取ORF2蛋白質之獲得ORF2蛋白質之方法。進一步需要的係獲得大量的足以有效地製備疫苗組合物之重組ORF2蛋白質之方法。更進一步需要的係用於獲得ORF2蛋白質之方法，其不需要通用之ORF2蛋白質提取協定所要求之複雜及勞動密集的方法。最後，就組合物而言，在此項技術中需要一種免疫原組合物，其在對抗PCV2感染中給與保護性免疫且減輕與此相關之臨床徵象之嚴重性或預防與此相關之臨床徵象。
    本發明克服先前技術中所固有的問題且提供在目前工藝水平上之顯著進步。詳言之，本發明之一態樣提供製備及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質之改良方法，i)藉由容許以含有PCV2 ORF2 DNA編碼序列之重組病毒載體感染在培養物中之易感染細胞，其中ORF2蛋白質係由該重組病毒載體表現，及ii)其後在上清液中回收該ORF2。已意外地發現若允許感染及隨後受感染細胞之培育進行超過一般先前PCV2 ORF2回收過程(其係自細胞內提取PCV2 ORF2)，則ORF2將大量地釋放進入上清液中。此外，已驚人地發現，PCV ORF2蛋白質對製備細胞外之原型降解係穩定的。兩個發現同時容許自細胞培養物上清液中回收大量PCV2 ORF2蛋白質，其中該細胞培養物感染了含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體。大量PCV2 ORF2蛋白質意謂大於約20 μg/mL上清液，較佳大於約25 μg/mL，更佳大於約30 μg/mL，更佳大於約40 μg/mL，更佳大於約50 μg/mL，更佳大於約60 μg/mL，更佳大於約80 μg/mL，更佳大於約100 μg/mL，更佳大於約150 μg/mL，最佳大於約190 μg/mL。彼等表現率亦可例如藉由如實例1至3中所述方法達成。
    較佳之細胞培養物具有介於約0.3-2.0×106細胞/毫升，更佳約0.35-1.9×106細胞/毫升，更佳約0.4-1.8×106細胞/毫升，更佳約0.45-1.7×106細胞/毫升，且最佳約0.5-1.5×106細胞/毫升之間的細胞數。較佳細胞係藉由熟習此項技術者測定。較佳細胞係彼等易被合適的含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體感染之細胞。較佳該細胞為昆蟲細胞，且更佳地其包括在註冊商標Sf+昆蟲細胞下售出之昆蟲細胞(Protein Sciences Corporation，Meriden,CT)。
    合適的生長培養基亦係藉由熟習此項技術者用較佳生長培養基測定，該生長培養基係去血清昆蟲細胞培養基諸如Excell 420(JRH Biosciences，Lenexa，KS)及類似物。較佳之病毒載體包括桿狀病毒諸如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen，San Diego,CA)，尤其是若該等製備細胞係昆蟲細胞時。雖然該桿狀病毒表現系統較佳，彼等熟習此項技術者瞭解其它表現系統可用於本發明之目的，即將PCV2 ORF2表現至細胞培養物之上層清液中。該等其它表現系統可需要利用一訊號序列以引起ORF2表現至培養基中。已驚人地發現當ORF2係藉由一桿狀病毒表現系統製備時，其不需要任何訊號序列或進一步修飾以引起ORF2表現至培養基。咸信此蛋白質可獨立地形成類病毒粒子(Journal of General Virology，81卷，第2281-2287頁，(2000))且被分泌至培養物上清液中。當用於感染易感細胞時，含有PCV2 ORF2 DNA序列之重組病毒載體具有介於約0.03-1.5之間的較佳病毒感染劑量(MOI)，更佳約0.05-1.3，更佳約0.09-1.1，且最佳約0.1-1.0。較佳上述MOI係關於一毫升細胞培養物流體。較佳地，本文所述之方法包含用一含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF蛋白質之重組病毒載體感染0.35-1.9×106細胞/毫升，更佳約0.4-1.8×106細胞/毫升，更佳約0.45-1.7×106細胞/毫升，且最佳約0.5-1.5×106細胞/毫升，該PCV2 ORF蛋白質具有介於約0.03-1.5，更佳約0.05-1.3，更佳約0.09-1.1，且最佳約0.1-1.0之間的MOI(病毒感染劑量)。
    接著將該等受感染細胞在多至10天的期間內培育，更佳約2天至約10天，更佳約4天至約9天，且最佳約5天至約8天。較佳培育條件包括介於約22-32℃，較佳約24-30℃，更佳約25-29℃，甚至更佳約26-28℃之間，且最佳約27℃之溫度。較佳地，在接種之後觀察到Sf+細胞之特徵桿狀病毒誘發之變化。該觀察可包括監測在感染後期間內細胞密度趨勢及降低之生存能力。發現在感染之後3-5天觀察到峰值病毒滴度，且在第5天與第8天之間及/或當細胞生存能力降低至小於10%時獲得ORF2自細胞釋放至上清液之峰值。
    因此，本發明之一態樣提供一種較佳以上述量製備及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質之改良方法，其係藉由以下步驟達成：i)容許用重組病毒載體以如上所界定之MOI感染在培養物中之許多易感細胞(參看上面)，ii)藉由該重組病毒載體表現PCV2 ORF2蛋白質，及iii)其後在感染之後第5天與第8天之間及/或細胞生存能力降低至低於10%時回收在細胞上清液中之PCV2 ORF2。較佳，該重組病毒載體係含有PCV2 ORF2 DNA編碼序列之重組桿狀病毒且該等細胞為Sf+細胞。另外，最好在感染後期間週期性地檢查該培養物以找到污染之宏觀及微觀證明或找到細胞形態中之非典型性變化。應丟棄呈現任何污染之任何培養物。較佳，該經表現ORF2重組蛋白質係藉由細胞分泌至保持細胞生存能力之周圍生長培養基中。接著在細胞周圍上清液中而非自細胞自身回收ORF2。
    該回收過程較佳係開始於經由一分離步驟自培養基中經表現之ORF2分離細胞碎片。較佳之分離步驟包括過濾、在高達約20,000×g之速度下離心、連續流動離心、利用離子交換或凝膠過濾之層析分離及習知之免疫親和方法。此等方法為熟習此項技術者已知，例如由(Harris及Angel(主編)之Protein purification methods-a practical approach,IRL press Oxford 1995)。最佳分離方法包括在高達約20,000×g之速度下離心及過濾。較佳之過濾法包括末端封閉微量過濾及切向流動(或橫流)過濾，包括空心纖維過濾末端封閉微量過濾。其中，末端封閉微量過濾較佳。用於末端封閉微量過濾之較佳孔徑係介於約0.30-1.35 μm之間，更佳介於約0.35-1.25 μm之間，更佳介於約0.40-1.10 μm之間，且最佳介於約0.45-1.0 μm之間。咸信任何習知濾過薄膜可用於本發明之目的，且聚醚碸薄膜較佳。任何低重量核酸物種係在過濾步驟期間被移除。
    因此，本發明之另一態樣提供一種較佳以上述量製備及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質之改良方法，其係藉由以下步驟達成：i)容許用重組病毒載體以如上所界定之MOI感染在培養物中之許多易感細胞(參看上面)，ii)藉由該重組病毒載體表現PCV ORF2蛋白質，iii)在感染之後第5天與第8天之間及/或細胞生存能力降低至低於10%時回收在細胞上清液中之PCV2 ORF2，及iv)經由一分離步驟自經表現之PCV2 ORF2分離細胞碎片。較佳，該重組病毒載體為含有ORF2 DNA編碼序列之重組桿狀病毒且該等細胞為SF+細胞。較佳之分離步驟係如上所述之彼等步驟。最佳係利用微孔尺寸介於約0.30-1.35 μm之間，更佳在約0.35-1.25 μm之間，更佳在約0.40-1.10 μm之間，且最佳在約0.45-1.0 μm之間的薄膜之末端封閉微量過濾。
    為了回收將用於免疫原或免疫組合物諸如疫苗之PCV2 ORF2，較佳包含一減活步驟以使病毒載體減活。"免疫原或免疫組合物"係指包含至少一種抗原之物質組合物，該抗原引起細胞宿主中之免疫反應及/或對相關組合物或疫苗之抗體介導之免疫反應。通常，"免疫反應"包括但不限於一或多種以下效應：抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或yd T細胞之產生或活化，詳言之係針對包括在相關組合物或疫苗中之一或數種抗原。較佳，宿主將顯示治療或者保護性的免疫反應，以便對新感染之抵抗力提高及/或疾病之臨床嚴重性降低。該等保護將藉由受感染宿主通常顯示之症狀之降低或者缺少、較快的痊癒時間及/或受感染宿主中降低之病毒滴度來證明。因此，本發明亦係關於較佳以上述量製備及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質之方法，其係藉由以下步驟達成i)容許用重組病毒載體以如上所界定之MOI感染在培養物中之許多易感細胞(參看上面)，ii)藉由該重組病毒載體表現PCV ORF2蛋白質，iii)在感染之後第5天與第8天之間及/或細胞生存能力降低至低於10%時回收在細胞上清液中之PCV2ORF2,iv)經由一分離步驟自經表現之PCV2 ORF2分離細胞碎片，及v)使該重組病毒載體減活。
    較佳，此減活在過濾步驟之前或過濾步驟之後進行，過濾步驟之後係較佳減活時間。任何習知減活方法均可用於本發明之目的。因此，減活可藉由化學及/或物理處理來執行。在較佳形式中，採集流體之體積係判定且溫度係介於約32-42℃之間，更佳介於約34-40℃之間，且最佳介於約35-39℃之間。較佳之減活方法包括添加環化二元伸乙基亞胺(BEI)，較佳係以約1至約20 mM之濃度，較佳約2至約10 mM，更佳約2至約8 mM，更佳約3至約7 mM，最佳約5 mM之濃度。例如，減活包括添加2-溴乙二胺氫溴酸鹽之溶液(較佳約0.4M)，其已在0.3M NaOH中被環化至0.2M二元伸乙基亞胺(BEI)，至流體中以得到約5 mM BEI之最終濃度。較佳，接著將該流體連續攪拌72-96小時，且接著經減活之所採集的流體可在-40℃下或在約1-7℃以下或之間冷凍儲存。在減活完成之後，添加較佳為1.0M之硫代硫酸鈉溶液以中和任何殘餘的BEI。較佳地，硫代硫酸鈉係以相對於先前添加之減活用BEI之當量添加。例如：在BEI添加至5 mM之最終濃度情況下，添加1.0M硫代硫酸鈉溶液以得到5 mM之最終最低濃度以中和任何殘餘BEI。
    因此，本發明之另一態樣係關於較佳以上述量製備重組PCV2 ORF2蛋白質之方法，其係藉由以下步驟達成：i)容許用重組病毒載體以如上所界定之MOI感染在培養物中之許多易感細胞(參看上面)，ii)藉由該重組病毒載體表現PCV ORF2蛋白質，iii)在感染之後第5天與第8天之間及/或細胞生存能力降低至低於10%時回收在細胞上清液中之PCV2 ORF2，iv)經由一分離步驟自經表現PCV2 ORF2分離細胞碎片，及v)使該重組病毒載體減活。較佳，該重組病毒載體為含有ORF2 DNA編碼序列之桿狀病毒且該等細胞係SF+細胞。較佳之分離步驟係上述彼等步驟，最佳係過濾步驟。較佳之減活步驟係上述彼等步驟。較佳，減活係在介於約35-39℃之間及在2至8 mM BEI存在下，更佳在約5 mM BEI存在下執行。已驚人地發現，更高濃度之BEI不利於感染PCV2 ORF2蛋白質。
    根據本發明之另一態樣，如上所述之方法亦包括在步驟v)之後的一中和步驟。此步驟vi)包含添加中和溶液中減活試劑之當量的試劑。較佳，若該減活試劑為BEI，則較佳添加硫代硫酸鈉至一當量之量。因此，根據另一態樣，當減活試劑為BEI時，步驟vi)包含添加硫代硫酸鈉溶液至約1至約20 mM之最終濃度，較佳約2至約10 mM，更佳約2至約8 mM，更佳約3至約7 mM，最佳約5 mM。
    在較佳形式中且尤其在將重組PCV2 ORF2蛋白質用於免疫原組合物諸如疫苗之形式中，將藉由在固著依賴性桿狀病毒易感之Sf+細胞中繼代來測試減活之各批採集之ORF2。在此測試之較佳形式中，150 cm2之合適的細胞培養物單層係用1.0 ml減活PCV2流體培育，且在25-29℃下保持14天至少2個繼代。在保持期間最後，檢查細胞單層之PCV2 ORF2桿狀病毒典型之細胞致病變效應(CPE)。較佳，亦使用陽性病毒對照物。該等對照物可由接種了未經減活之參考PCV2 ORF2桿狀病毒之Sf+細胞的培養物及一燒瓶保持未接種之Sf+細胞組成。在培育及繼代之後，在經BEI處理之病毒流體中不存在病毒感染細胞將形成令人滿意之減活測試。以參考病毒接種之對照細胞應呈現PCV2 ORF2桿狀病毒典型的CPE，且未接種之燒瓶不應呈現任何PCV2 ORF2桿狀病毒CPE之證據。或者，在保持週期最後，可將上層清液樣本收集且接種到一已裝載Sf+細胞之Sf+96孔培養盤上，且接著在25-29℃下維持5-6天。接著將該培養盤固定且用結合至FITC之抗PCV2 ORF2抗體染色。藉由IFA顯微鏡檢測，在經BEI處理之病毒流體中不存在CPE及ORF2表現將形成一滿意之減活測試。以參考病毒接種之對照細胞應呈現CPE及IFA活性，且未經接種之燒瓶不應呈現PCV2 ORF2桿狀病毒CPE之任何證據且不含有IFA活性。
    因此，本發明之另一態樣係關於一種用於判定重組病毒載體減活之有效性的減活測試，其包含以下步驟：i)較佳如上所述，將至少一部份之含有重組病毒載體之培養液與減活試劑接觸，ii)添加中和試劑以中和該減活試劑，較佳如上所述，及iii)藉由如上所述之檢定測定剩餘感染性。
    在減活以後，樣本中之重組PCV2 ORF2蛋白質之相對數量可以多種方式測定。較佳之定量方法包括SDS-PAGE密度測定法、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、及將已知之疫苗量與臨床結果(血清學，等等)相關之動物接種研究。當使用SDS-PAGE定量時，將含有未知量重組PCV2 ORF2蛋白質之樣本材料與含有不同已知量重組PCV2 ORF2蛋白質之樣本一起在凝膠上流動。接著可根據該等已知樣本製得一標準曲線，且在未知樣品中之重組PCV2 ORF2之量可藉由與此標準曲線相對照來測定。因為酶聯免疫吸附測定係通常公認用於抗原定量之行業標準，其用於定量係較佳的。
    因此，根據另一態樣，本發明亦係關於一種用於定量重組PCV2 ORF2蛋白質之酶聯免疫吸附測定。由此所提供之一較佳酶聯免疫吸附測定通常將起始於在塗佈緩衝液中稀釋俘獲抗體至1:6000或一合適的工作稀釋度。較佳之俘獲抗體為經純化之豬抗PCV2 PAb Prot. G，且較佳之塗佈緩衝液為0.05M碳酸鹽緩衝液，其可藉由組合2.93 g NaHCO3(Sigma Cat. No. S-6014,或等效物)與1.59 g NaCO3(Sigma Cat. No. S-6139,或等效物)來製備。將該混合物與蒸餾水或等效物組合以得到一公升pH值為9.6±0.1之溶液。接著將俘獲抗體在塗佈緩衝液中稀釋至1:6000或任何其它合適的工作稀釋度。例如，對於4個培養盤，一個將需要42 mL塗佈緩衝液及7 μL俘獲抗體。利用反向移液管法，將100 μL經稀釋之俘獲抗體添加至所有孔中。為了獲得一平均的塗佈，應輕輕地拍各個培養盤之側面。接著在堆疊該等培養盤且用一空的96孔培養盤蓋帽該堆疊前，將該等培養盤用培養盤密封物密封。將培養盤在35-39℃下培育隔夜(14-24小時)。接著利用超洗滌加微滴度洗碟器(設置在250 μL/洗滌、洗滌3次且不浸泡)將各個培養盤用洗滌緩衝液洗滌3次。在最後洗滌之後，應將培養盤輕拍至一個紙巾上。再次，應利用反向吸移管技術，將250 μL阻斷液添加至所有孔中。應將測試盤密封且在35-37℃下培育大約一小時(±5分鐘)。較佳，此步驟之後該等培養盤未堆疊。在阻斷步驟期間，應將全部測試樣本拔出且在室溫下解凍。接著，將藉由添加200 μL稀釋液至所有剩餘孔(除列A及列H，行1-3外)中來製備四個獨立的稀釋培養盤。接著，將6個測試試管貼上標籤如下：低滴度、中滴度、高滴度、減活/濾過(1:240)，減活/濾過(1:480)及內部對照。在該等指定試管中，製備一合適的稀釋度以用於以下測試樣本。應在使用之前渦旋解凍之測試樣本。對於四個培養盤，將製備以下稀釋度：A)低滴度將未經預稀釋：3.0 mL之低滴度；B)在1:30稀釋度之陰性對照(SF+細胞)：3.77 mL稀釋劑+130 μL代型陰性對照；C)在1:30稀釋度之中滴度(8 μg/mL)：3.77 mL稀釋劑+130 μL中滴度；D)在1:90稀釋度之高滴度(16 μg/mL) : 2. 967 mL稀釋劑+33 μL高滴度；E)在1:240稀釋度之減活/濾過：2.39 mLs稀釋劑+10 μL失活/濾過樣本；F)在1:480稀釋度之減活/濾過：1.0 mL稀釋劑+1.0 mL自上述E製備之減活/濾過(1:240)樣本；G)在1:30稀釋度之內部對照：3.77 mL稀釋劑+130 μL內部對照。接著，對於培養盤1至4添加300 μL所製備之樣本至稀釋培養盤中對應的空孔中。接著將多通道吸移管管理器設定至100 μL，且將列A中之物質藉由吸移管上下混合至少5次，且接著利用反向吸移管技術將100μL轉移至列B中。應換掉尖頭且沿著培養盤進行此相同的程序至列G。現已準備好將在該等稀釋培養盤中之樣本轉移至測試培養盤中，只要測試培養盤已利用超洗滌加微滴度洗碟器(設置在250 μL/洗滌、3次洗滌、不浸泡)用洗滌緩衝液洗滌3次。在最後洗滌之後，應將培養盤輕拍至一個紙巾上。接著，利用一簡單轉移程序將稀釋培養盤中之物質轉移至測試培養盤中。更詳言之，自列H開始，利用反向吸移管技術將100 μL/孔自稀釋培養盤轉移至測試培養盤之對應孔中。在每次轉移之後，應換掉吸移管尖頭。自列G開始，利用反向吸移管技術將在稀釋培養盤中之100 μL/孔轉移至測試培養盤之對應孔中。對於剩餘轉移可以使用同一套吸移管尖頭。為了確保均質溶液轉移，應在轉移之前將溶液上下吸移移至少3次。接著將測試培養盤密封且在37℃±2.0℃下培育1.0小時±5分鐘。此外，最好培養盤未經堆疊。接著將培養盤利用超洗滌加微滴度洗碟器(設置在250 μL/洗滌、3次洗滌且不浸泡)用洗滌緩衝液洗滌3次。在最後洗滌之後，應將培養盤輕拍至一個紙巾上。利用反向吸移管技術，將100 μL在稀釋溶液中1:300或合適工作稀釋度稀釋之檢測抗體添加至測試培養盤之所有代型孔中。例如，對於4個培養盤，一個將需要42 mL含有140 μL俘獲抗體之稀釋溶液。接著將測試培養盤密封且在37℃±2.0℃下培育1.0小時±5分鐘。再次，將培養盤利用超洗滌加微滴度洗碟器(設置在250 μL/洗滌、3次洗滌且不浸泡)用洗滌緩衝液洗滌3次。在最後洗滌之後，應將培養盤輕拍至一個紙巾上。接著，藉由添加1%正常家兔血清至稀釋劑中來製備結合稀釋劑。例如：對於四個培養盤，將420 μL正常家兔血清添加至42 mL稀釋劑中。在新鮮製備之結合稀釋劑溶液中將結合抗體稀釋至1:10,000或任何其它合適的工作稀釋度至測試培養盤之所有孔中。利用反向吸移管技術，將100 μL稀釋結合抗體添加至所有孔中。接著將測試培養盤密封且在37℃±2.0℃下培育45±5分鐘。較佳，該等培養盤未經堆疊。接著將培養盤利用超洗滌加微滴度洗碟器(設置在250 μL/洗滌、3次洗滌且不浸泡)用洗滌緩衝液洗滌3次。在最後洗滌之後，應將培養盤輕拍至一個紙巾上。接著，在使用之前將等量之TMB過氧化酶基質(試劑A)與過氧化酶溶液B(試劑B)立即混合。混合量將視培養盤數量而變化，但每個培養盤需要10毫升/培養盤+2 mL。因此，對於4個培養盤，將要21毫升試劑A+21毫升試劑B。利用反向吸移技術，將100 μL基質添加至測試培養盤之所有的孔中。接著將該等培養盤在室溫下培育15分鐘±15秒。藉由利用反向吸移技術向所有孔中添加100 μL 1N HCl溶液來停止反應。接著將酶聯免疫吸附測定培養盤讀取器打開且容許以習知方式進行其診斷程式及測試相。
    本發明之另一態樣係關於一種方法，其係用於建構含有PCV2 ORF2 DNA且當感染進入易感細胞時大量表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體。已驚人地發現本文所提供之重組病毒載體在感染易感細胞之後大量地(如上界定)表現PCV2 ORF2。因此，本發明亦係關於一種用於製備及/或回收PCV2 ORF2蛋白質之改良方法，較佳包含以下步驟：建構含有PCV2 ORF2 DNA且表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體。較佳，該病毒載體為重組桿狀病毒。如下描述本文提供的用於建構含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體之方法的細節：在較佳形式中，該等用於感染細胞之含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體係藉由將其中已具有本文所選殖之ORF2基因的轉移載體轉染至病毒載體中而產生。較佳，僅將轉移載體之一部分轉染至含有ORF2 DNA之病毒載體中。術語"被轉染至病毒載體中"意謂且係用作"引入"或"選殖"一種異源DNA進入病毒載體(例如進入桿狀病毒載體)中之同義語。該等病毒載體較佳而不必為桿狀病毒。
    因此，根據本發明之另一態樣，重組病毒載體係藉由在含有異源PCV2 ORF2 DNA轉移載體與病毒載體(較佳為桿狀病毒，更佳為諸如Baculo Gold DNA之線狀複製缺陷桿狀病毒)之間重組而產生。"轉移載體"意謂包括至少一個複製起源之DNA分子，異源基因(在目前的情況下為PCV2 ORF2)及容許選殖異源基因進入該病毒載體之DNA序列。較佳地容許選殖異源基因進入病毒載體之序列為側接異源基因。更佳地彼等側接序列與該病毒載體序列至少部分同源。接著該序列同源性容許病毒載體及轉移載體之兩種分子重組以產生含有異源基因之重組病毒載體。一較佳之轉移載體為pVL1392載體(BD Biosciences Pharmingen)，其係經設計用於與BaculoGold DNA共轉染進入較佳之Sf+細胞株。較佳，該轉移載體包含PCV2 ORF2 DNA。該共轉染之建構為大約10,387鹼基對長度。
    在更佳形式中，本發明之方法將自分離PCV2 ORF2 DNA開始。一般而言，此可來自已知或未知菌株，因為ORF2 DNA似乎在不同分離株之間高度保守，其具有至少約95%序列一致性。在此項技術中已知之任何PCV2 ORF2基因均可用於本發明之目的，因為每個都將表現進入上清液中。該PCV ORF2 DNA較佳係利用PCR方法擴增，更佳同時引入5'側接Kozak一致序列(CCGCCAUG)(SEQ ID NO 1)及/或3'側接EcoR1位點(GAATTC)(SEQ ID NO 2)。如此引入5'Kozak一致序列較佳地移除PCV2 ORF2之自然產生之起始密碼子AUG。該3' EcoR1位點較佳係在PCV2 ORF2終止密碼子下游引入。更佳其係在多聚腺苷酸轉錄終止序列之下游引入，使得其本身位於PCV2 ORF2終止密碼子下游。已發現，利用Kozak一致序列，如上所詳述，增加隨後PCV2 ORF2蛋白質之表現量。具有該等額外序列之經擴增之PCV2 ORF2 DNA係選殖至載體中。用於此初始選殖步驟之較佳載體為pGEM-T-Easy載體(Promega,Madison,WI)。包括若干pGEM載體序列(SEQ ID NO: 7)之PCV2 ORF2 DNA較佳係在Notl限制性內切位點自該載體切除。接著將所得DNA選殖至該轉移載體中。
    因此，在本發明之一態樣中，提供一種用於建構含有PCV2 ORF2 DNA之重組病毒載體之方法。此方法包含以下步驟：i)將重組PCV2 ORF2選殖至轉移載體中；及ii)將含有重組PCV2 ORF2之轉移載體之一部分轉染至病毒載體中以產生重組病毒載體。較佳，該轉移載體係如上所述之載體或如上所述建構或如圖1所示範。因此，根據另一態樣，用於構造如本文所述之重組病毒載體之轉移載體含有SEQ ID NO: 7序列。
    根據另一態樣，此方法進一步包含在步驟i)之前的以下步驟：活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，其中PCV2 ORF2 DNA之側接序列係如上所述來修飾。用於擴增PCV2 ORF2 DNA及修飾側接序列之活體外方法、將經活體外擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體中及適當的轉移載體係如上所述，示範於圖1，或為熟習此項技術者所知。因此，根據另一態樣，本發明係關於一種用於建構含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體之方法，其包含下述步驟：i)活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，其中該PCV2 ORF2 DNA之側接序列係經修飾，ii)將該經擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體中；及iii)將含有重組PCV2 ORF2 DNA之轉移載體或其一部分轉染至病毒載體中以產生重組病毒載體。較佳，PCV2 ORF2 DNA之側接序列之修飾係如上所述來執行，例如較佳如上所述藉由引入5' Kozak序列及/或EcoR1位點。
    根據另一態樣，提供一種製備及/或回收由PCV2之開放閱讀框架2表現之重組蛋白質之方法。該等方法通常包含下述步驟：i)將重組PCV2 ORF2選殖至轉移載體中；ii)將含有重組PCV2 ORF2之轉移載體之一部分轉染至病毒中；iii)用該經轉染之病毒感染在培養基中之細胞；iv)引起該等經轉染之病毒自PCV2 ORF2表現重組蛋白質；v)自該上清液分離細胞；及vi)自上清液回收經表現之PCV2 ORF2蛋白質。
    如何將重組PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體之方法係如上所述。較佳，該轉移載體含有SEQ ID NO:3、SEQ ED NO:4、SEQ ID NO:7序列。然而，該轉移載體可含有任何PCV2 ORF2 DNA(未經修飾或經修飾)，只要當經轉染至重組病毒載體中時該PCV2 ORF2 DNA在細胞培養物中表現。較佳，該重組病毒載體包含SEQ ED NO:8之序列。此外，如何感染細胞(較佳如何以界定數目之含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒感染昆蟲細胞)之方法係如上所詳述。此外，自上清液分離細胞之步驟以及用於回收經表現至PCV2 ORF2蛋白質之步驟亦如上所詳述。如本文所述之任何此等特定處理步驟係如上所述之製備及/或回收由PCV2之開放閱讀框架2表現之重組蛋白質之方法之一部分。較佳，該等細胞為SF+細胞。更佳，細胞培養物具有介於約0.3-2.0×106細胞/毫升，更佳約0.35-1.9×106細胞/毫升，更佳約0.4-1.8×106細胞/毫升，更佳約0.45-1.7×106細胞/毫升，且最佳約0.5-1.5×106細胞/毫升之間的細胞數。較佳，當用於感染易感細胞時，含有PCV2 ORF2 DNA序列之重組病毒載體具有介於約0.03-1.5之間的較佳病毒感染劑量(MOI)，更佳約0.05-1.3，更佳約0.09-1.1，更佳約0.1-1.0，且最佳約0.5。較佳，回收在第5天及第8天之間及/或細胞生存能力降低至低於10%時獲得之細胞上清液中之PCV2 ORF2蛋白質。較佳，為了製備PCV2 ORF2蛋白質，將細胞在25至29℃下培養。較佳，該分離步驟為離心或過濾步驟。
    視情況，此方法包括在選殖PCV2 ORF2 DNA至轉移載體中之前擴增來自PCV2菌株之PCV2 ORF2 DNA之步驟。在較佳形式中，5' Kozak序列、3' EcoR1位點、及其組合亦可添加至擴增序列中，較佳係在擴增之前或期間，較佳之5'Kozak序列包含SEQ ID NO:1。較佳之3' EcoR1位點包含SEQ ID NO:2。較佳之PCV2 ORF2 DNA包含核苷酸序列Genbank Accession No. AF086834(SEQ ID NO:3)及SEQ ID NO:4。較佳之重組PCV2 ORF2蛋白質包含SEQ ID NO:5(其係藉由SEQ ID NO:3(Genbank Accession No. AF086834)編碼之蛋白質)及SEQ ID No:6(其係藉由SEQ ID NO:4編碼之蛋白質)之胺基酸序列。較佳之培養基包含去血清昆蟲細胞培養基，Excell 420培養基更佳。當執行視需要之擴增步驟時，最好首先將經擴增之開放閱讀框架2選殖至第一載體中，自第一載體切除該開放閱讀框架2，及使用該等切除之開放閱讀框架用於選殖至轉移載體中。用於共轉染之較佳細胞株為SF+細胞株。用於共轉染之較佳病毒為桿狀病毒。在此方法之較佳形式中，轉移載體之經轉染之部分包含SEQ ID NO:8。最後，對於此方法，最好在用病毒感染細胞之後至少5天回收細胞培養物上清液中之代型PCV2開放閱讀框架2(ORF2)蛋白質。
    因此，本發明之另一態樣係關於一種製備及/或回收PCV2開放閱讀框架2之方法，其包含以下步驟：i)活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，較佳藉由添加5' Kozak序列及/或藉由添加3' EcoR1限制性內切位點，ii)將經擴增之PCV2 ORF2選殖至轉移載體中；iii)將含有重組PCV2 ORF2之轉移載體之一部分轉染至病毒中；iv)用該經轉染之病毒感染在培養基中之細胞；v)引起該等經轉染之病毒由PCV2 ORF2表現重組蛋白質；vi)自上清液分離細胞；及vii)自上清液回收經表現之PCV2 ORF2蛋白質。
    本發明之另一態樣係關於一種用於製備包含PCV2 ORF2蛋白質及減活病毒載體之組合物的方法。此方法包含下述步驟：i)將經擴增之PCV2 ORF2選殖至轉移載體中；ii)將含有重組PCV2 ORF2之轉移載體之一部分轉染至病毒中；iii)用經轉染之病毒載體感染在培養基中之細胞；iv)引起該經轉染之病毒載體自PCV2 ORF2表現重組蛋白質；v)自上清液分離細胞；vi)自上清液回收經表現之PCV2 ORF2蛋白質；及vii)使重組病毒載體減活。較佳，該重組病毒載體為含有ORF2 DNA編碼序列之桿狀病毒且該細胞為SF+細胞。較佳之分離步驟係上述彼等步驟，最佳為過濾步驟。較佳之減活步驟係上述彼等步驟。較佳，減活係在35-39℃之間且在2至8 mM BEI存在下執行，更佳在約5 mM BEI存在下。已驚人地發現更高濃度之BEI不利於感染PCV2 ORF2蛋白質，且更低濃度不能有效地在24至72小時減活作用之內使病毒載體減活。較佳，減活係執行至少24小時，更佳24至72小時。
    根據另一態樣，如上所述用於製備包含PCV2 ORF2蛋白質及減活病毒載體之組合物的方法亦包括在步驟vii)之後的中和步驟。此步驟viii)包含添加中和溶液中減活試劑之等效量的試劑。較佳若該減活試劑為BEI，則最好添加硫代硫酸鈉至等效量。因此根據另一態樣，當減活試劑為BEI時，步驟viii)包含添加硫代硫酸鈉溶液至約1至約20 mM之最終濃度，較佳約2至約10 mM，更佳約2至約8 mM，更佳約3至約7 mM，最佳約5 mM。
    根據另一態樣，如上所述用於製備包含PCV2 ORF2蛋白質及減活病毒載體之組合物的方法包含在步驟i)之前的以下步驟：活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，其中該PCV2 ORF2 DNA之側接序列係如上所述經修飾。用於擴增PCV2 ORF2 DNA及修飾側接序列之活體外方法，將活體外經擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體中及適當的轉移載體係如上所述，示範於圖1，或為熟習此項技術者所知。因此，根據另一態樣，此方法包含以下步驟：i)活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，其中該PCV2 ORF2 DNA之側接序列係經修飾；ii)將該經擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體中；及iii)將該含有重組PCV2 ORF2 DNA之轉移載體或其一部分轉染至病毒載體中以產生重組病毒載體；iv)用該經轉染之病毒感染在培養基中之細胞；v)引起該經轉染之病毒自PCV2 ORF2表現該等重組蛋白質；vi)自上清液分離細胞；vii)自上清液回收經表現之PCV2 ORF2蛋白質；viii)使該等重組病毒載體，較佳在約1至約20 mM BEI存在下，最佳在約5 mM BEI存在下減活；及ix)添加等效量試劑以中和溶液中之減活試劑，當減活試劑為BEI時，較佳添加硫代硫酸鈉溶液至約1至約20 mM，較佳約5 mM之最終濃度。
    在本發明之另一態樣中，提供一種用於製備組合物，較佳抗原組合物諸如疫苗以用於引起對抗PCV2之免疫反應的方法。一般而言，此方法包括將一建構轉染至病毒中之步驟，其中該建構包含i)來自PCV2 ORF2之重組DNA，ii)用經轉染之病毒感染在生長培養基中之細胞，iii)引起病毒自PCV2 ORF2表現重組蛋白質，iv)自上清液回收經表現之ORF2蛋白質，v)及藉由將該回收蛋白質與適當的佐劑及/或其它醫藥上可接受之載劑組合來製備該組合物。
    如本文所用之"佐劑"可包括氫氧化鋁及磷酸鋁，皂角苷，例如Quil A,QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)，GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳劑，水包油乳劑，水包油包水乳劑。該乳劑可尤其基於輕液體石蠟油(European Pharmacopea類型)；諸如角鯊烷或角鯊烯之類異戊二烯油；由烯烴(尤其是異丁烯或癸烯)齊聚所得之油；含有直鏈烷基之酸或醇類之酯，更特定言之為植物油類，油酸乙酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油基三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇類之酯，尤其為異硬脂酸酯。該油與乳化劑組合使用以形成乳劑。乳化劑較佳為非離子型界面活性劑，尤其是山梨聚糖、二縮甘露醇(例如脫水甘露醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯類，尤其是Pluronic產品，特別是L121。參看Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tull,D. E. S.). John Wiley and Sons,NY，第51-94頁(1995)and Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。
    例如，可能使用由M. Powell及M. Newman所編Plenum出版社1995年之"Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach"147頁上描述之SPT乳劑及同一本書183頁上描述之MF59乳劑。
    佐劑之另一實體為選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利的佐劑化合物為經交聯的，特別是與糖或多元醇之聚烯醚交聯之丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。此等化合物已藉由術語卡波姆已知(Phameuropa第8卷，第2期，6月，1996)。熟習此項技術者亦可以參看美國專利第2,909,462號，其描述與一種多羥基化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，該多羥基化合物具有至少3個羥基，較佳不超過8個，至少3個羥基之氫原子係經具有至少2個碳原子之不飽和脂族烴基取代。較佳基團係彼等含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其它乙烯系不飽和基團。不飽和基團可自身含有其它取代基，諸如甲基。在Carbopol名下銷售的產品(BF Goodrich,Ohio,USA)尤其合適。其係與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。使用Cabopol 971P最佳。在順丁烯二酸酐及烯基衍生物之共聚物之中，共聚物EMA(Monsanto)係順丁烯二酸酐及乙烯之共聚物。該等聚合物在水中溶解形成酸性溶液，其將被中和(較佳至生理學pH)以得到佐劑溶液，免疫原、免疫或疫苗組合物本身將被併入該佐劑溶液中。
    其它適當的佐劑包括但不限於RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA--、單磷醯基脂質A、Avridine脂質-胺佐劑，來自大腸桿菌之熱不穩定性腸毒素(重組體或其它)、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯基二肽等其它佐劑。
    較佳，佐劑係以約100 μg至約10 mg每劑量之量添加。更佳，佐劑係以約100 μg至約10 mg每劑量之量添加。更佳，佐劑係以約500 μg至約5 mg每劑量之量添加。更佳，佐劑係以約750 μg至約2.5 mg每劑量之量添加。最佳該佐劑係以約1 mg每劑量之量添加。
    因此，根據另一態樣，用於製備抗原組合物諸如疫苗以引起對抗PCV2之免疫反應的方法包含i)製備及回收PCV2 ORF2蛋白質，及ii)將其與適當的佐劑混合。較佳，該佐劑為Carbopol 971P。更佳，Carbopol 971P係以約500 μg至約5 mg每劑量之量，更佳以約750 μg至約2.5 mg每劑量之量且最佳以約1 mg每劑量之量添加。較佳，該處理步驟i)包括如所述之用於製備及回收PCV2 ORF2之處理步驟，例如，在此方法之較佳形式中，在轉移載體中獲得包含PCV2 ORF2 DNA之建構。適當的轉移載體及其製備方法係如上所述。視情況，該方法可包括在將ORF2選殖至轉移載體中之前經由PCR擴增來自PCV2菌株之ORF2之步驟。較佳之開放閱讀框架序列、Kozak序列、3'EcoR1位點序列、重組蛋白質序列、經轉染之建構序列、培養基、細胞及病毒係如先前方法所述。用於此方法之另一視情況之步驟包括將該經擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至第一載體中，由此第一載體切除該ORF2 DNA，及將該切除之PCV2 ORF2 DNA用於選殖至轉移載體中。如同其它方法，自上清液回收重組ORF2蛋白質之前，較佳在藉由經轉染之桿狀病毒感染細胞之後等待至少5天。較佳，此方法之回收步驟亦包括自細胞及細胞碎片中分離培養基之步驟。其可以多種途徑完成，但是為了簡單方便，最好經由一具有在約0.45 μM至約1.0 μM範圍內小孔之過濾器過濾該細胞、細胞碎片及生長培養基。最後，對於此方法，最好包括在將該回收之重組PCV2 ORF2蛋白質組合至組合物中之前的病毒減活步驟。此可以多種途徑完成，但是最好在本發明之實踐中使用BEI。
    因此，根據另一態樣，此方法包含以下步驟：i)活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，其中該PCV2 ORF2 DNA之側接序列係經修飾，ii)將該經擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體中；及iii)將該含有重組PCV2 ORF2 DNA之轉移載體或其一部分轉染至病毒載體中以產生重組病毒載體，iv)用該經轉染之病毒感染在培養基中之細胞；v)引起該經轉染之病毒自PCV2 ORF2表現該重組蛋白質；vi)自上清液分離細胞；vii)自上清液回收經表現之PCV2 ORF2蛋白質；viii)使該重組病毒載體，較佳在約1至約20 mM BEI存在下，最佳在約5 mM BEI存在下減活；ix)添加等效量中和溶液中之減活試劑的試劑，當減活試劑為BEI時，較佳添加硫代硫酸鈉溶液至約1至約20 mM，較佳地約5 mM之最終濃度。及x)添加適當量之佐劑，較佳添加Carbopol，更佳為Carbopol 97IP，更佳以如上所述量添加(例如，以約500 μg至約5 mg每劑量之量，更佳以約750 μg至約2.5 mg每劑量之量，且最佳以約1 mg每劑量之量)。
    另外，該組合物可包括一或多種醫藥上可接受之載劑。如本文所用，"一種醫藥上可接受之載劑"包括任何及所有溶劑、分散介質、塗佈劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲試劑及其類似物。最佳，本文所提供之組合物含有自活體外培養細胞之上清液中回收之PCV2 ORF2蛋白質，其中該等細胞感染上含有PCV2 ORF2 DNA及表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體，且其中該細胞培養物係以約2至約8 mM BEI，較佳約5 mM BEI來處理以使病毒載體減活；及一當量濃度之中和試劑，較佳為約2至約8 mM，較佳約5 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液；Carbopol(更佳為Carbopol 971P，較佳以約500 μg至約5 mg每劑量之量，更佳以約750 μg至約2.5mg每劑量之量及最佳以約1 mg每劑量之量)；及生理鹽水，較佳以約50至約90%(v/v)，更佳約60至80%(v/v)，更佳地約70%(v/v)之量。
    因此，另一態樣係關於一種用於製備抗原組合物諸如疫苗以引起對抗PCV2之免疫反應的方法，其包含以下步驟：i)活體外擴增PCV2 ORF2 DNA，其中該PCV2 ORF2 DNA之側接序列係經修飾；ii)將該經擴增之PCV2 ORF2 DNA選殖至轉移載體中；及iii)將該含有重組PCV2 ORF2 DNA之轉移載體或其一部分轉染至病毒載體中以產生重組病毒載體；iv)用該經轉染之病毒感染在培養基中之細胞；v)引起該經轉染之病毒自PCV2 ORF2表現該重組蛋白質；vi)自上清液分離細胞；vii)自上清液回收經表現之PCV2 ORF2蛋白質；viii)使該重組病毒載體減活，較佳在約2至約20 mM BEI存在下，最佳在約5 mM BEI存在下；ix)添加等效量中和溶液中之減活試劑的試劑，當減活試劑為BEI時，較佳添加硫代硫酸鈉溶液至約0.5至約20 mM，較佳約5 mM之最終濃度；x)添加適當量之佐劑，較佳添加Carbopol，更佳為Carbopol 971P，更佳以如上所述量添加，例如約500 μg至約5 mg每劑量，更佳約750 μg至約25 mg每劑量之量及最佳約1 mg每劑量之量；及xi)添加生理鹽水，較佳地以約50至約90%(v/v)之量，更佳至約60至80%(v/v)，更佳約70%(v/v)。視情況，此方法亦可包括添加保護劑。如本文所用之保護劑係指抗微生物活性劑，諸如慶大黴素、硫柳汞及其類似物。詳言之，添加保護劑用於製備多劑量組合物最佳。彼等抗微生物活性劑以可有效防止相關組合物之任何微生物的污染或抑制相關組合物內之任何微生物成長之濃度添加。
    此外，此方法亦可包含添加任何穩定劑，諸如醣類、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖及其類似物以增加及/或保持產物貯藏期限。然而，已驚人地發現，未添加任何其它穩定劑時，所得調配物在至少24個月期間內係免疫有效的。
    本發明之另一態樣係關於如上所述由該等方法獲得之產物。詳言之，本發明係關於一種包含經重組表現之PCV2 ORF2蛋白質之物質組合物。此外，本發明亦係關於一種物質組合物，其包含自昆蟲細胞培養物上清液中回收之經重組表現之PCV2 ORF2蛋白質。此外，本發明亦係關於一種物質組合物，其包含自昆蟲細胞培養物上清液中回收之經重組表現之PCV2 ORF2蛋白質。較佳，此物質組合物亦包含適合於使病毒載體減活之試劑。較佳，該減活試劑為BEI。此外，本發明亦係關於一種物質組合物，其包含自昆蟲細胞培養物上清液中回收之經重組表現之PCV2 ORF2蛋白質，且包含適於使病毒載體減活之試劑(較佳為BEI)及用於中和減活試劑之中和試劑。較佳，當BEI係用作減活試劑時，此中和試劑為硫代硫酸鈉。
    在本發明之又一態樣中，提供一種免疫原組合物，其對PCV2感染之臨床徵象引起免疫反應且更佳給與保護性免疫。該等組合物通常包含藉由PCV2之開放閱讀框架2(ORF2)表現之多肽或其片段作為組合物之抗原組份。
    本文所用之用於製備組合物及亦在本文所提供之方法內使用之PCV2 ORF2DNA及蛋白質為在PCV2分離株內之高度保守區，任何PCV2 ORF2將有效用作本文所用之PCV ORF2 DNA及/或多肽之來源。較佳之PCV2 ORF2蛋白質為SEQ ID NO.11之蛋白質。本文之一較佳PCV ORF2多肽係作為SEQ ED NO.5來提供，但是熟習此項技術者應瞭解此序列可在序列同源性上變化差不多在6-10%，且仍保持抗原性特徵，其在免疫原組合物中仍為適用的。免疫組合物之抗原性特徵可例如藉由實例4提供之攻毒試驗來評估。此外，當相對於藉由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之聚核苷酸序列編碼之PCV2 ORF2蛋白質，修飾抗原給與至少70%，較佳80%，更佳90%保護性免疫時，修飾抗原之抗原性特徵仍舊保持。本文所用之"免疫原組合物"意謂引起在細胞之宿主中之免疫反應及/或對抗PCV2 ORF2蛋白質之抗體介導免疫反應的PCV2 ORF2蛋白質。較佳，此免疫原組合物能夠針對PCV2感染及與此相關之臨床徵象給與保護性免疫。在某些形式中，PCY2 ORF2蛋白質之免疫原部分係用作該組合物中之抗原組份。本文所用之術語"免疫原部分"分別係指PCV2 ORF2蛋白質及/或聚核苷酸之截斷及/或取代形式或片段。較佳，該等經截斷及/或取代形式，或片段將包含至少6個來自全長ORF2多肽之連續胺基酸。更佳，該等經截斷及/或取代形式，或片段將具有至少10個，更佳至少15個，且更佳至少19個來自全長ORF2多肽之連續胺基酸。在此態樣中之兩個較佳序列在本文中係作為SEQ ID NO. 9及10來提供。進一步應瞭解該等序列可為更大片段或經截斷形式之一部分。本文所提供之一更佳PCV2 ORF2多肽係藉由SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之核苷酸序列編碼。但是熟習此項技術者應瞭解此序列可在序列同源性上變化差不多在6-20%，且仍保持抗原性特徵，其在免疫原組合物中係適用的。在某些形式中，ORF2之經截斷或取代之形式，或片段係用作組合物中之抗原組份。較佳，該等經截斷或取代之形式，或片段將包含至少18個自該全長ORF2核苷酸序列之(例如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之)連續核苷酸。更佳，該等經截斷或取代之形式，或片段將具有至少30個，更佳至少45個，及更佳至少57個來自全長ORF2核苷酸序列之(例如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之)連續核苷酸。
    如在此項技術中已知，"序列一致性"係指在兩個或兩個以上多肽序列或兩個或兩個以上聚核苷酸序列(即一參考序列與一待與該參考序列對照之給定序列)之間的關係。序列一致性係藉由在序列已最佳對準至產生最高程度之序列類似性之後對照給定序列與參考序列來測定，其係藉由在該等"序列"鏈之間匹配來測定。經過該等對準，序列一致性係在位置接位置基礎上確定，例如，若在一位置核苷酸或胺基酸殘基吻合則該等序列在該特殊位置為"相同的"。接著將該等位置一致性之總數除以在參考序列中之核苷酸或殘基的總數得到%序列一致性。序列一致性可易於藉由已知方法計算，包括但不限於下列內容中描述之彼等方法：Computational Molecolar Biology,Lesk,A.N.,編，Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,編，Academic Press,New York(1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H. G.,編，Humana Press,New Jersey(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.，學術出版社(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M and Devereux,J.,編，M. Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H,and Lipman,D.,SIAM J. Applied Math.,48: 1073(1988),其中之教示以引用方式併入本文中。測定序列一致性之較佳方法係經設計成能得到在測試序列之間的最大匹配。測定序列一致性之方法係編纂在測定給定序列之間之序列一致性之公開可利用的電腦程式中。該等程式之實例包括但不限於GCG程式包(Devereux,J.等,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984)),BLASTP,BLASTN and FASTA(Altschul,S. F.等,J. Molec. Biol.,215:403-410(1990). BLASTX程式可以公開地從NCBI及其它來源中獲得(BLAST Manual,Altschul,S.等，NCVI NLM NTH Bethesda,MD 20894,Altschul,S. F.等J. Molec. Biol.,215:403-410(1990))，其中之教示以引用的方式併入本文中。該等程式利用預設間隙重量最佳地對準序列以產生最高水平之在給定與參考序列之間的序列一致性。舉例說明，若一聚核苷酸具有與參考核苷酸序列至少例如85%，較佳90%，更佳95%"序列一致性"之核苷酸序列，則意謂除了給定聚核苷酸序列可包括多達15個，較佳多達10個，更佳多達5個點突變/100個該參考核苷酸序列之核苷酸外，給定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列吻合。換言之，在一具有相對於參考核苷酸序列至少例如85%，較佳90%，更佳95%一致性的核苷酸序列之聚核苷酸中，參考序列中多達15%，較佳10%，更佳5%之核苷酸可缺失或以另一核苷酸取代，或多達參考序列中核苷酸總數之15%，較佳10%，更佳5%之若干核苷酸可插入參考序列中。參考序列之該等突變可產生在參考核苷酸序列之5'或3'終端位置或在彼等終端位置之間的任何位置，個別地散佈在參考序列中核苷酸之中或者散佈在參考序列內之一個或更多個連續基團中。類似地，若一多肽具有與參考胺基酸序列至少例如85%，較佳90%，更佳95%序列一致性的胺基酸序列，則意謂除了給定多肽序列可包括多達15個，較佳多達10個，更佳多達5個胺基酸變換/100個該參考胺基酸序列之胺基酸外，該給定多肽胺基酸序列與參考序列吻合。換言之，為獲得具有與參考胺基酸序列最少85%，較佳90%，更佳95%序列一致性之給定多肽序列，參考序列中之多達15%，較佳10%，更佳5%之胺基酸殘基可缺失或用另一胺基酸取代，或多達該參考序列中之胺基酸殘基總數15%，較佳10%，更佳5%之若干胺基酸可插入該參考序列中，參考序列之該等變換可以產生在參考胺基酸序列之胺基或羧基終端位置或在彼等終端位置之間的任何位置，個別地散佈在參考序列中之殘基之中或者散佈在參考序列內之一個或更多個連續基團中。較佳，不同的殘基位置係藉由保守胺基酸取代來區別。然而，當測定序列一致性時，保守性取代不包括作為匹配。
    本文所用之"序列同源性"係指一種測定兩個序列之相關性的方法。為測定序列同源性，將兩個或兩個以上序列最佳地對準，且若必要時則引入間隙。然而，與"序列一致性"相反，當測定序列同源性時保守性胺基酸取代將被當作一種匹配。換言之，為獲得具有與參考序列95%序列同源性之多肽或聚核苷酸，參考序列中之85%，較佳90%，更佳95%之胺基酸殘基或核苷酸必須與另一胺基酸或核苷酸匹配或包含保守性置換，或多達參考序列中胺基酸殘基或核苷酸(不包括保守性置換)總數15%，較佳多達10%，更佳多達5%之若干胺基酸或核苷酸可插入該參考序列中。較佳該同源序列包含50，更佳100，更佳250，更佳500核苷酸之至少一個伸展。
    "保守性取代"係指一胺基酸殘基或核苷酸以另一具有類似特徵或特性(包括尺寸，疏水性等等)之胺基酸殘基或核苷酸來取代，使得總體功能性未顯著改變。
    "經分離的"意謂"藉由人類手工"地將其自然狀態改變，意即，若其自然發生，則其已自其初始環境改變或移除或兩者均發生。例如，如本文所用之該術語，自然地存在於活有機體中之聚核苷酸或多肽未經"分離"，但自其自然狀態之共存材料分離之相同的聚核苷酸或多肽係經"分離"。
    因此，本發明之另一態樣係關於一種包含PCV2 ORF2蛋白質之有效用於減輕與PCV2感染相關之臨床症狀之嚴重性的免疫原組合物。較佳，該PCV2 ORF2蛋白質為任何如上所述彼等蛋白質。較佳，該PCV2 ORF2蛋白質為：
    i)　包含SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 9，SEQ ID NO: 10或SEQ ED NO: 11之序列的多肽；
    ii)　與i)之多肽至少80%同源之任何多肽，
    iii)　i)及/或ii)之多肽之任何免疫原部分
    iv)　iii)之免疫原部分，包含包括在SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 9，SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列中至少10個連續胺基酸，
    v)　藉由包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4序列之DNA編碼的多肽。
    vi)　藉由與v)之聚核苷酸至少80%同源之聚核苷酸編碼的任何多肽，
    vii)　藉由v)及/或vi)之聚核苷酸編碼之多肽的任何免疫原部分
    viii)　vii)之免疫原部分，其中用於編碼該免疫原部分之聚核苷酸包含包括於SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之序列中的至少30個連續核苷酸。
    較佳，任何彼等免疫原部分具有藉由SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之序列編碼之PCV2 ORF2蛋白質的免疫原特徵。
    根據另一態樣，PCV2 ORF2蛋白質係以有效引起所需免疫反應(即降低由PCV2感染產生之臨床徵象之發病率或減輕該臨床徵象之嚴重性)之抗原包含量提供在免疫組合物中。較佳，該PCV2 ORF2蛋白質包含量為至少0.2 μg抗原/ml最終免疫原組合物(μg/ml)，更佳約0.2至約400 μg/ml，更佳約0.3至約200 μg/ml，更佳約0.35至約100 μg/ml，更佳約0.4至約50 μg/ml，更佳約0.45至約30 μg/ml，更佳約0.6至約15 μg/ml，更佳約0.75至約8 μg/ml，更佳約1.0至約6 μg/ml，更佳約1.3至約3.0 μg/ml，更佳約1.4至約2.5 μg/ml，更佳約1.5至約2.0 μg/ml，且最佳約1.6 μg/ml。
    根據另一態樣，該ORF2抗原包含量係如上所述之至少0.2 μg PCV2 ORF2蛋白質每劑量最終抗原組合物(μg/劑量)，更佳約0.2至約400 μg/劑量，更佳約0.3至約200 μg/劑量，更佳約0.35至約100 μg/劑量，更佳約0.4至約50 μg/劑量，更佳約0.45至約30 μg/劑量，更佳約0.6至約15 μg/劑量，更佳約0.75至約8 μg/劑量，更佳約1.0至約6 μg/劑量，更佳約1.3至約3.0 μg/劑量，更佳約1.4至約2.5 μg/劑量，更佳約1.5至約2.0 μg/劑量，且最佳約1.6 μg/劑量。
    用於根據本發明之免疫原組合物中之PCV2 ORF2多肽可以包括PCV2 ORF2之分離及純化、標準蛋白質合成、及重組方法之任何方式獲得。用於獲得PCV2 ORF2多肽之較佳方法係在上文描述且亦提供於美國專利申請案第11/034,797號中，其教示及內容係以引用的方式併入本文中。簡要地，用含有PCV2 ORF2 DNA編碼序列之重組病毒載體感染易感細胞，藉由該重組病毒表現PCV2 ORF2多肽，且藉由過濾自上清液中回收該經表現之PCV2 ORF2多肽，且藉由任何習知方法較佳利用二元伸乙基亞胺使該PCV2 ORF2多肽減活，接著其係經中和以停止減活過程。
    因此，根據另一態樣該免疫原組合物包含i)較佳以如上所述之濃度的任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，及ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，較佳為重組桿狀病毒之至少一部份。此外，根據另一態樣，該免疫原組合物包含i)較佳以如上所述之濃度的任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，及ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，較佳為重組桿狀病毒之至少一部份，及iii)一部分細胞培養物上清液。
    根據PCV2 ORF2蛋白質之製備及回收方法之一特定實施例，該細胞培養物上清液係經由具有較佳介於約0.45至1 μm之間微孔尺寸之薄膜來過濾。因此，另一態樣係關於一種免疫原組合物，其包含i)較佳以如上所述濃度的任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，及ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，較佳為重組桿狀病毒之至少一部份，及iii)一部分細胞培養物；其中約90%之該等組份具有小於1 μm之尺寸。
    根據另一態樣，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含i)較佳以如上所述濃度之任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，iii)一部分細胞培養物，iv)及使該等重組病毒載體減活之減活試劑，較佳為BEI，其中約90%之組份i)至iii)具有小於1 μm之尺寸。較佳，BEI係以使桿狀病毒減活之有效濃度存在。有效濃度係如上所述。
    根據另一態樣，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含i)較佳以如上所述濃度之任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，iii)一部分細胞培養物，iv)使該重組病毒載體減活之減活試劑，較佳為BEI，及v)停止藉由該減活試劑介導之減活作用之中和試劑，其中約90%之組份i)至iii)具有小於1 μm之尺寸。較佳若該等減活試劑為BEI，則該組合物包含與BEI等效量之硫代硫酸鈉。
    該多肽係併入可投予PCV2感染易感動物之組合物中。在較佳形式中，該組合物亦可包括為熟習此項技術者已知之額外組份(亦參看Remington's Pharmaceutical Sciences.(1990)。第18版Mack Publ.,Easton)。另外，該組合物可包括一或多種獸醫上可以接受之載劑。如本文所用，"一種獸醫上可接受之載劑"包括任何及所有溶劑、分散介質、塗佈劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲試劑及其類似物。
    在一較佳實施例中，該免疫原組合物包含較佳以如上所述濃度的本文所提供之PCV2 ORF2蛋白質作為抗原組份，其係與佐劑(較佳為Carbopol及生理鹽水)混合。
    熟習此項技術者將瞭解本文中之組合物可併入已知可注射之生理上可接受之無菌溶液。對於製備腸胃外注射用或輸液用之即用溶液，可易於利用含水等滲溶液，諸如鹽水或相應血漿蛋白溶液。另外，本發明之免疫原及疫苗組合物可包括稀釋劑、等滲劑、穩定劑或佐劑。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及類似物。等滲劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、及乳糖等其它物質。穩定劑包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽等其它物質。適當的佐劑係如上所述之彼等佐劑。最佳係使用Carbopol(尤其使用Carbopol 971P)，較佳以如上所述量使用，例如約500 μg至約5 mg每劑量之量，更佳以約750 μg至約25 mg每劑量之量，及最佳以約1 mg每劑量之量。
    因此，本發明亦係關於一種免疫原組合物，其包含i)較佳以如上所述濃度之任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，iii)一部分細胞培養物，iv)使該重組病毒載體減活之減活試劑，較佳為BEI，及v)停止藉由該減活試劑介導之減活作用之中和試劑，較佳為以與BEI等效量之硫代硫酸鈉，及vi)適當的佐劑，較佳為如上所述量之Carbopol 971；其中約90%之組份i)至iii)具有小於1 μm之尺寸。根據另一態樣，此免疫原組合物進一步包含一種醫藥上可接受之鹽，較佳為以生理上可接受濃度之磷酸鹽。較佳，將該免疫原組合物之pH值調節至一生理學pH值，意謂介於約6.5與7.5之間。
    因此，本發明亦係關於一種免疫原組合物，每一毫升該免疫原組合物包含i)至少1.6 μg之任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之桿狀病毒，iii)一部分細胞培養物，iv)約2至8 mM BEI，v)與BEI等效量之硫代硫酸鈉，及vi)約1 mg Carbopol 971，及vii)以生理上可接受濃度之磷酸鹽；其中約90%之組份i)至iii)具有小於1 μm之尺寸，且該免疫原組合物之pH值係經調節為約6.5至7.5。
    該免疫原組合物可進一步包括一或多種諸如介白素、干擾素或其它細胞活素之其它免疫調節劑。該免疫原組合物亦可包括慶大黴素及硫柳汞。適用於本發明上下文之佐劑及添加劑之量及濃度可藉由熟練工人容易地判定，本發明涵蓋包含約50 μg至約2000 μg之佐劑及較佳約250 μg/ml劑量之疫苗組合物的組合物。在另一較佳實施例中，本發明涵蓋包含約1 μg/ml至約60 μg/ml抗菌素，及更佳小於約30 μg/ml抗菌素之疫苗組合物。
    因此，本發明亦係關於一種免疫原組合物，其包含i)較佳以如上所述濃度之任何如上所述之PCV2 ORF2蛋白質，ii)至少一部份表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，iii)一部分細胞培養物，iv)使該重組病毒載體減活之減活試劑，較佳為BEI，及v)停止藉由該減活試劑介導之減活作用之中和試劑，較佳為以與BEI等效量之硫代硫酸鈉，vi)適當的佐劑，較佳為如上所述量之Carbopol 971，vii)醫藥上可接受濃度之鹽水緩衝液，較佳為磷酸鹽，及viii)抗微生物活性劑；其中約90%之組份i)至iii)具有小於1 μm之尺寸。
    已驚人地發現，本文所提供之免疫原組合物在24個月期間內高度穩定。亦已發現本文所提供之免疫原組合物(含有本文提供之重組桿狀病毒表現之PCV2 ORF2蛋白質)在降低與PCV2感染相關之臨床症狀上及其有效。已驚人地發現，含有本文所提供之重組桿狀病毒表現之PCV2 ORF2蛋白質之免疫原組合物比包含減活形式之整個PCV2病毒之免疫原組合物或經分離之病毒PCV2 ORF2抗原有效。詳言之，已驚人地發現該重組桿狀病毒表現之PCV2 ORF2蛋白質在極低濃度下有效，其意謂在達至0.25 μg/劑量之濃度。該PCV2 ORF2蛋白質之意外的高免疫原潛力可藉由添加Carbopol進一步提高。
    另一態樣係關於一種容器，其包含至少一個劑量之本文所提供之PCV2 ORF2蛋白質的免疫原組合物，其中一個劑量包含至少2 μg PCV2 ORF2蛋白質，較佳為2至16 μg PCV2 ORF2蛋白質。該容器可包含1至250劑量之該免疫原組合物，較佳其含有1、10、25、50、100、150、200或250劑量之PCV2 ORF2蛋白質之免疫原組合物。較佳，包含超過一個劑量PCV2 ORF2蛋白質之免疫原組合物的各容器進一步包含抗微生物活性劑。彼等試劑為例如抗菌素，包括慶大黴素及硫柳汞及類似物。因此，本發明之一態樣係關於一種容器，其包含1至250劑量之PCV2 ORF2蛋白質的免疫原組合物，其中一個劑量包含至少2 μg PCV2 ORF2蛋白質，及慶大黴素及/或硫柳汞，較佳約1 μg/ml至約60 μg/ml之抗菌素，且更佳小於約30 μg/ml。
    另一態樣係關於一種套組，其包含如上所述之任何容器，及一使用手冊，其包括將至少一個劑量PCV2 ORF2蛋白質免疫原組合物經肌內投予小豬以減輕與PCV2感染相關之臨床症狀之嚴重性的資訊。此外，根據另一態樣，該使用手冊包含第二次或進一步投予至少一個劑量PCV2 ORF2免疫原組合物之資訊，其中第二次投藥或更進一步投藥係超過初始投藥或任何先前投藥至少14天。較佳，該使用手冊亦包括投予投予免疫刺激劑之資訊。較佳，該免疫刺激劑應給與至少兩次。較佳，在第一次及第二次或任何進一步投予免疫刺激劑之間為至少3天，更佳至少5天，更佳至少7天。較佳，在超過初始投予PCV2 ORF2蛋白質免疫原組合物至少10天，較佳15天，更佳20天，更佳至少22天再給與免疫刺激劑。較佳之免疫刺激劑之實例為鑰孔血藍蛋白(KLH)，更佳係以弗氏不完全佐劑乳化(KLH/ICFA)之蛋白。然而，由此應瞭解亦可以使用為熟習此項技術者所知之任何其它免疫刺激劑。本文所用之"免疫刺激劑"意謂可觸發免疫反應(較佳無需引發或增強特異性免疫反應，例如針對一特定病原體之免疫反應)之任何試劑或組合物。進一步指示在一適當之劑量投予該免疫刺激劑。此外，該套組亦可包含一容器，包括至少一個劑量之免疫刺激劑，較佳為一個劑量之KLH或KLH/ICFA。
    此外，亦已驚人地發現該包含重組桿狀病毒表現之PCV2 ORF2蛋白質的免疫原組合物(較佳與Carbopol組合)之免疫原潛力可藉由投予IngelVac PRRS MLV疫苗進一步提高(參看實例5)。當存在PRRS感染時，PCV2臨床徵象及疾病表現極大地放大。然而，本文所提供之免疫原組合物及接種疫苗策略極大地且超過預期地減輕了此效應。換言之，當用本文所提供之任何PCV2 ORF2免疫原組合物及Ingelvac PRRS MLV疫苗(Boehringer Ingelheim)治療動物(較佳為豬)時，觀察到一意外之協同效應。
    因此，本發明之另一態樣係關於如上所述之含有本文所提供之PCV2 ORF2免疫原組合物及使用手冊之套組，其中該使用手冊進一步包括一起投予該PCV2 ORF2免疫原組合物及含有PRRS抗原(較佳為輔佐PRRS抗原)之免疫原組合物的資訊。較佳，該PRRS抗原係以Carbopol輔佐。較佳，該PRRS抗原為IngelVac PRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。
    本發明之另一態樣亦關於一種套組，其包含i)一含有至少一個劑量本文所提供之PCV2 ORF2免疫原組合物之容器。及ii)一含有包含PRRS抗原(較佳為輔佐PRRS抗原)之免疫原組合物的容器。較佳，該PRRS抗原係以Carbopol輔佐。較佳該PRRS抗原為IngelVac PRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。更佳，該套組進一步包含一使用手冊，其包括投予此兩種醫藥組合物的資訊。較佳，其含有該資訊：剛好在含有PRRS之組合物之前投予含有PCV2 ORF2之組合物。
    另一態樣係關於本文所提供之任何組合物作為藥劑，較佳作為獸醫藥劑，更佳作為疫苗之用途。此外，本發明亦係關於本文所述之任何組合物用於製備用於減輕與PCV2感染相關之臨床症狀之嚴重性之藥劑的用途。較佳，該藥劑係用於預防PCV2感染，更佳為在小豬中。
    另一態樣係關於一種方法，其係用於(i)預防PCV2之感染或再感染(ii)降低或消除在受檢者中之由PCV2所引起之臨床症狀，其包含投予本文所提供之任何免疫原組合物至需要其之受檢者。較佳，該受檢者為豬。較佳，該免疫原組合物係經肌肉內投藥。較佳，投予一個劑量或兩個劑量之免疫原組合物，其中一個劑量較佳包含至少約2 μg PCV2 ORF2蛋白質，更佳約2至約16 μg，及至少約0.1至約5毫克Carbopol，較佳約1毫克Carbopol。另一態樣係關於如上所述之治療方法，其中進行第二次施用該免疫原組合物。第二次投藥係用相同免疫原組合物(較佳具有相同數量PCV2 ORF2蛋白質)完成。較佳，第二次投藥係經肌肉內給予。較佳，第二次投藥係超過初始投藥至少14天，更佳超過初始投藥至少4星期後完成。
    根據另一態樣，該治療方法亦包含投予免疫刺激劑。較佳，該免疫刺激劑應投予至少兩次。較佳，在第一次與第二次投予免疫刺激劑之間為至少3天，更佳至少5天，更佳至少7天。較佳，在超過初始投予PCV2 ORF2免疫原組合物至少10天，較佳15天，更佳20天，更佳至少22天後再投予免疫刺激劑。較佳之免疫刺激劑之實例為鑰孔血藍蛋白(KLH)，更佳係以弗氏不完全佐劑乳化(KLH/ICFA)之蛋白。然而，由此應瞭解亦可使用為熟習此項技術者所知之任何其它免疫刺激劑。熟習此項技術者具有在投予一適當劑量之免疫刺激劑的一般知識。
    根據另一態樣，如上所述之治療方法亦包含投予PRRS抗原。較佳，該PRRS抗原係用Carbopol輔佐。較佳，該PRRS抗原為IngelVac PRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。較佳，該PRRS抗原係在剛好投予PCV2 ORF2蛋白質免疫原組合物後投予。
    以下實例闡述根據本發明之較佳材料及程序。然而應瞭解，該等實例僅作為說明而提供，且其中沒有任何內容被認為對本發明之全部範疇之限制。 實例1
    此實例比較利用本發明之方法與用先前技術中已知之方法的ORF2之相對產率。將四個1000 ml旋轉瓶每個用在300 ml去昆蟲血清培養基Excell 420(JRH生物科學股份有限公司，Lenexa，KS)中之大約1.0×106 Sf+細胞/ml接種。主細胞培養物經確定為SF+(草地黏蟲(Spodoptera frugiperda))主細胞庫，繼代19，Lot#N112-095W。用於產生SF+主細胞庫之細胞係自蛋白質科學股份有限公司，Meriden CT獲得。用於此實例之SF+細胞株係限制在繼代19與59之間。其它繼代可用於本發明之目的，但是為了用於擴大過程而用於大規模生產，至少19繼代將可能為必需的，且超過59之繼代可影響表現，儘管其未經調查。更詳細地，來自液氮貯槽之初始SF+細胞培養物係懸浮生長在持續攪動之無菌旋轉瓶中之Excell 420培養基中。該培養物係生長在含有25至150 ml Excell 420去血清培養基之100 ml至250 ml旋轉瓶中。當細胞已繁殖至1.0-8.0×106細胞/ml之細胞密度時，將其分至具有0.5-1.5×106細胞/ml之種植密度之新容器中。隨後之擴張培養物將在尺寸達至36升之旋轉瓶中或在達至300升之不銹鋼生物反應器中在25-29℃下生長2-7天之時期。
    在接種後，該燒瓶將在27℃下培育四小時。隨後，將每個燒瓶用含有PCV2 ORF2基因(SEQ ID NO:4)之重組桿狀病毒接種。含有該PCV2 ORF2基因之重組桿狀病毒係如下產生：來自北美PCV2菌株之PCV2 ORF2基因係經PCR擴增以含有一5' Kozak序列(SEQ ID NO:1)及一3' EcoRl位點(SEQ ID NO:2)，經選殖至該pGEM-T-Easy載體(Promega,Madison,WI)中。接著，隨後將其切除且次選殖至轉移載體pVL1392(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)中。該經次選殖之部分在本文中係表示為SEQ ID NO:7。含有該PCV2 ORF2基因之pVL1392質體係命名為N47-064Y且接著以BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen)桿狀病毒DNA共轉染至Sf+昆蟲細胞(蛋白質科學，Meriden,CT)中以產生含有PCV2 ORF2基因之重組桿狀病毒。新的建構在本文中係作為SEQ ID NO:8來提供。含有PCV2 ORF2基因之重組桿狀病毒係經斑點法純化，且主種病毒(MSV)係在SF+細胞株上繁殖，等分試樣，且在-70℃下儲存。MSV係藉由PCR-RFLP利用桿狀病毒特異性引子肯定地確定為PCV2 ORF2桿狀病毒。感染上PCV2 ORF2桿狀病毒以產生MSV或工作接種病毒之昆蟲細胞表現PCV2 ORF2抗原，其係藉由多選殖血清或單選殖抗體在間接螢光抗體檢定中檢測。另外，PCV2 ORF2桿狀病毒之身份係藉由N末端胺基酸序列確認。該PCV2 ORF2桿狀病毒MSV亦係根據9 C.F.R 113.27(c)、113.28、113.55來測定純度。每個接種進入旋轉瓶之重組桿狀病毒具有不同病毒感染劑量(MOI)。燒瓶1用7.52 mL.088 MOI種子接種；燒瓶2用3.01 ml之0.36MOI種子接種；燒瓶3用1.5 ml 0.18MOI種子接種；及燒瓶4用0.75 mL 0.09MOI種子接種。本文提供如圖1之示意流程圖，其說明用於建構PCV2 ORF2 ORF2重組桿狀病毒之基本步驟。
    用桿狀病毒接種之後，接著將燒瓶在27±2℃下培育7天且在此期間在100 rpm下攪拌。該燒瓶使用通風帽以使得空氣流動。在隨後7天內每24小時取來自每個燒瓶之樣本。在提取之後，將每個樣本離心，且將離心塊及上清液兩者均分離，接著經由一0.45-1.0 μm微孔尺寸薄膜微過濾。
    接著經由酶聯免疫吸附測定檢定對所得樣本中存在之ORF2量定量。酶聯免疫吸附測定檢定係用純化俘獲抗體豬抗PCV2 Pab IgG Prot.G(在PBS 1:250稀釋)在0.05M碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)稀釋至1:6000進行。接著將100 μL抗體放入微滴度培養盤之孔中，密封，且在37℃下培育隔夜。接著將該培養盤用洗滌溶液洗滌3次，該洗滌溶液包含0.5 mL吐溫20(Sigma,St. Louis,MO)，100 ml 10X D-PBS(Gibco Invitrogen,Carlsbad,CA)及899.5 mL蒸餾水。隨後，向每一孔中添加250微升阻斷液(5 g康乃馨脫脂奶粉(Nestle,Glendale,CA)在10 mL D-PBS QS中加蒸餾水至100 ml)。下一步係洗滌測試培養盤且接著添加預稀釋之抗原。該預稀釋之抗原係藉由向稀釋培養盤上之每一孔中添加200 μL稀釋溶液(0.5 mL吐溫20在999.5 ml D-PBS中)來製備。接著將該樣本在1:240比率及1:480比率下稀釋，且接著將100 μL此等稀釋樣本之各樣本添加至稀釋培養盤上之頂端孔中(意即一頂端孔接受100 μL 1:240稀釋劑及另一接受100 μL 1:480稀釋劑)。接著藉由自每個連續的孔移除100 μL且將其轉移至培養盤上之下一個孔中對培養盤之剩餘物進行連續稀釋。在進行下一次轉移之前先混合每個孔。測試培養盤洗滌包括用洗滌緩衝液洗滌培養盤3次。接著在用洗滌緩衝液再洗滌3次前，將培養盤密封且在37℃下培育1小時。所用之檢測抗體係對抗PCV ORF2之單選殖抗體。其係在稀釋溶液中稀釋至1:300，且接著向孔中添加100 μL該稀釋檢測抗體。接著在用洗滌緩衝液洗滌3次前，將培養盤密封且在37℃下培育1小時。接著藉由向稀釋溶液中添加正常家兔血清(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)至1%濃度來製備結合稀釋液。將結合抗體山羊抗老鼠(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)在結合稀釋液中稀釋至1:10,000。接著將100 μL稀釋結合抗體添加至各孔中。接著在用洗滌緩衝液洗滌3次前，將培養盤密封且在37℃下培育45分鐘。將100 μL基質(三甲苯過氧化酶基質，Kirkgaard及Perry實驗室(KPL)，Gaithersberg,MD)與等體積過氧化酶基質B(KPL)混合添加至各孔中。接著將培養盤在室溫下培育15分鐘。接著將100 μL 1N HCL溶液添加至所有孔中以停止反應。接著使培養盤通過酶聯免疫吸附測定讀取器。此檢定結果係提供於下表1中
    此等結果表明當延長培育時間時，進入離心細胞及培養基之上清液之ORF2表現多於離心細胞及培養基之離心塊中之表現。因此，容許ORF2表現進行歷時至少5天再在上清液回收它而不容許表現進行少於5天再自細胞回收ORF2，此極大增加了ORF2產率且顯著改良了先前方法。 實例2
    此實例提供關於本文所主張之發明之功效的資料。將一1000 ml旋轉瓶以在300 ml Excell 420培養基中之大約1.0×106 Sf+細胞/ml接種。接著將該燒瓶在27℃及100 rpm攪拌下培育。隨後，在24小時培育之後將該燒瓶以10 ml具有0.1 MOI之PCV2 ORF2/Bac p+6(在Sf9昆蟲細胞中額外繼代6次之含有PCV2 ORF2基因之重組桿狀病毒)病毒種子接種。
    接著將該燒瓶在27℃下培育總共6天。在培育後，接著將燒瓶離心，且將所得上清液之3個樣本採集及減活。藉由將其溫度升至37±2℃使該上清液減活。對於第一個樣本，將2-溴乙二胺氫溴酸鹽(其已在0.3N NaOH中環化成二元乙二胺(BEI))之0.4M溶液添加至上清液中以得到5 mM BEI之最終濃度。對於第二個樣本，向上層清液中添加10 mM BEI。對於第三個樣本，未向上層清液中添加BEI。接著將樣本連續不斷地攪拌48小時。添加1.0 M硫代硫酸鈉溶液(得到5 mM最終最低濃度)以中和任何剩餘BEI。接著利用如實例1所述之相同的酶聯免疫吸附測定檢定步驟對每個樣本中之ORF2之量進行定量。其結果係示於下表2中：
    此實例證明用BEI中和未移除或降解相當量該重組PCV2 ORF2蛋白質產物。此係藉由未由BEI或高溫引起上層清液中ORF2大量損失之此事實來證明。彼等熟習此項技術者知道該經回收之ORF2為穩定的蛋白質產物。 實例3
    此實例證明本發明可自小規模生產重組PCV2 ORF2擴大至大規模生產重組PCV2 ORF2。將7000 mL ExCell 420培養基中之5.0×105細胞/毫升之SF+細胞/毫升在一20000 mL Applikon生物反應器中培養。接著將培養基及細胞在27℃及在100 rpm攪拌下接著培育歷時以後的68小時。在第68小時，將41.3 ml PCV2 ORF2桿狀病毒MSV+3添加至7000 mL ExCell 420培養基中。接著將所得混合物添加至該生物反應器中。將該混合物在27℃及在100 rpm攪拌下接著培育7天。自第4天(感染後)開始每24小時提取來自生物反應器之樣本，且將每個樣本離心。保存樣本之上清液，接著利用SDS-PAGE密度測定法對ORF2量進行定量。其結果可示於下表3中：
    實例4
    此實例測試七個PCV2候選疫苗之效能且進一步界定曝露於PCV2惡毒菌株之後的效能參數。108個剖腹產取得之未經初乳(CDCD)之小豬，9-14天齡，被隨機分成具有相同尺寸之9組。表4闡述用於該實例之一般研究設計。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死的全細胞病毒=在適當的細胞培養物中培養之PCV2病毒
    七個組(組1-7)接受了若干劑量之PCV2 ORF2多肽，一個組作為攻毒對照未接受PCV2 ORF2，另一個組作為嚴格陰性對照亦未接受PCV2 ORF2。在第0天，組1至7經指定疫苗處理。在第14天對在組7中之小豬給予加強治療。接種疫苗後觀察小豬之不良事件及注射部位反應，且在第19天將小豬移至第二試驗點。在第二試驗點，將組1-8群放在一個建築中而組9放在一單獨建築中。所有的豬在第21及27天及第24天均接受鑰孔血藍蛋白(KLH)/弗氏不完全佐劑(ICFA)，將組1-8用惡毒PCV2攻毒。
    收集攻毒之前及之後之血樣用於PCV2血清診斷。攻毒後，收集用於測定平均日增重(ADWG)之體重資料，及臨床症狀，以及用於測定PCV2之鼻排出之鼻抽汲樣品。在第49天，將所有倖存豬屍體解剖，對肺評分用於測定損害，且將選擇之組織保存在福爾馬林中用於日後免疫組織化學(IHC)測試。 材料及方法
    此係在第0天在CDCD豬(9至14天齡)中進行之部分盲目疫苗接種-攻毒可行性研究。待包括在該研究中的是，母豬之PCV2 IFA滴度為=1:1000。另外，母豬之血清學狀況係來自習知之PRRS陰性獸群。測定28個母豬之PCV2血清學狀況。14個母豬具有=1000之PCV2滴度，且被轉移至第一個試驗點。110個小豬係藉由剖腹產手術產生且可用於第4天之研究。在第3天，稱量在第一試驗點之108個CDCD豬，用耳標鑑別，藉由重量分開且隨機分派成9組之1，如上在表4中所述。若滿足包含標準之任何試驗用動物係登記進入該研究中且後來由於任何原因被排除，調查監視員會商討以判定在最終分析中使用自該動物收集之資料。經登記之小豬之被排除日期及排除理由係記錄在案。最初，沒有母豬被排除。在第3天，將110個可利用豬中之總共108個隨機分派至9個組中之一組中。兩個最小的豬(第17及19號)未分派至組中，且若需要可作為額外使用。在該研究過程中，若干動物被移除。在攻毒之前，發現豬82號(組9)在第1天、豬56號(組6)在第3天、豬53號(組9)在第4天、豬28號(組8)在第8天、豬69號(組8)在第7天及豬93號(組4)在第9天各自死亡。此六個豬不包括在最終研究結果內。豬17號(一個額外之豬)被分派至組9中。剩餘之額外豬19號係自研究中排除。
    給予各組之調配物係如下：組1係設計成投予1 ml含有16 μg ORF2/ml之病毒ORF2(vORF2)。此係藉由混合10.24毫升病毒ORF2(256 μg/25 μg/ml=10.24 ml vORF2)與3.2毫升0.5% Carbopol及pH值為7.4之2.56毫升磷酸鹽緩衝生理食鹽水完成。以此方式製備16毫升用於組1之調配物。組2係經設計成投予1 ml含有8 μg vORF2/毫升之vORF2。此係藉由混合5.12毫升病毒vORF2(128 μg/25 μg/ml=5.12 ml vORF2)與3.2毫升0.5% Carbopol及pH值為7.4之7.68毫升磷酸鹽緩衝生理食鹽水而完成。以此方式製備16毫升用於組2之調配物。組3係設計成投予1 ml含有4 μg vORF2/毫升之vORF2。此係藉由混合2.56毫升病毒ORF2(64 μg/25 μg/ml=2.56 ml vORF2)與3.2毫升0.5% Carbopol及pH值為7.4之10.24毫升磷酸鹽緩衝生理食鹽水完成。以此方式製備16毫升用於組3之調配物。組4係設計成投予1 ml含有16 μg rORF2/毫升之重組ORF2(rORF2)。此藉由混合2.23毫升rORF2(512 μg/230 μg/ml=2.23 ml rORF2)與6.4毫升0.5% Carbopol及pH值為7.4之23.37毫升磷酸鹽緩衝生理食鹽水完成。以此方式製備32毫升用於組4之調配物。組5係設計成投予1 ml含有8 μg rORF2/毫升之rORF2。此係藉由混合1.11毫升rORF2(256 μg/230 μg/ml=1.11 ml rORF2)與6.4毫升0.5% Carbopol及pH值為7.4之24.49毫升磷酸鹽緩衝生理食鹽水完成。以此方式製備32毫升用於組5之調配物。組6係經設計成投予1 ml含有8 μg rORF2/毫升之rORF2。此係藉由混合0.56毫升rORF2(128 μg/230 μg/ml=0.56 ml rORF2)與6.4毫升0.5% Carbopol及pH值為7.4之25.04毫升磷酸鹽緩衝生理食鹽水完成。以此方式製備32毫升用於組6之調配物。組7係經設計成投予2 ml含有MAX PCV2 KV之PCV2全減活細胞疫苗(PCV2 KV)。此係藉由混合56毫升PCV2 KV與14毫升0.5% Carbopol完成。以此方式製備70毫升用於組7之調配物。最後組8係設計成投予在0.5 μg/ml或1.0 μg/ml每2毫升劑量之KLH。此係藉由混合40.71毫升KLH(7.0 μg蛋白質/毫升在0.5 μg/毫升=570毫升(7.0 μg/ml)(x)=(0.5)(570毫升))，244.29毫升pH值為7.4之磷酸鹽緩衝生理食鹽水及285毫升弗氏佐劑完成。表5描述用於此實例之關鍵活動的時間框架。

    在完成有生命階段之研究後，由病理學家用免疫組織化學(IHC)檢定經福爾馬林固定之組織以檢測PCV2抗原，血樣係經評分用於PCV2血清診斷，鼻抽汲樣本係經評分以檢測PCV2排出，且平均日增重(ADWG)係自第24天至第49天測定。
    在第一個試驗點動物係關在5個房間中之單獨的籠中自出生至大約11天齡(大約為研究之第0天)。每個房間在布局上相同，且係由堆疊之單個不銹鋼籠組成，該等籠係經加熱及過濾之空氣單獨地供應給各獨立單元。各房間具有獨立的供暖及通風設備，藉此防止房間之間空氣之交叉污染。在第二個試驗點將動物放入兩個不同建築中。組9(嚴格陰性對照組)係單獨地放在一改裝完工之建築中而組1-8係放在經改裝哺育之建築中。各組係放入獨立的圍欄(每圍欄11-12隻豬)中且各圍欄提供大約3.0平方英尺每隻豬。各圍欄係放在架高之具有塑料漏縫地板之甲板上。圍欄下的坑洞充當排泄物及廢物之儲料槽。各建築具有其自身獨立的供暖與通風系統，幾乎不可能具有在建築之間的交叉污染。
    在第一個試驗點，自出生至大約3週齡喂給小豬一種經特殊調配之乳定糧。所有小豬均吃固體的經特殊混合之定糧直至第19天(大約4週齡)。在第二試驗點，隨意喂給所有小豬一種適合於其年齡及體重之常規非用藥之商業混合定糧。在兩試驗點亦可隨意得到水。
    將所有測試豬在第-2天用維生素E治療，在第-1天用鐵注射液，且在第16,17,18及19天用NAXCEL(1.0毫升，交替在後腿肌肉注射)。另外，豬52號(組9)在第3天係以鐵注射液治療，豬45號(組6)在第11天係以鐵注射液治療，豬69號(組8)在第6天係用NAXCEL治療，豬74號(組3)在第14天係以地塞米松及青黴素治療，且由於不同健康原因豬51號(組1)在第13天係以地塞米松及青黴素治療且在第14天用NAXCEL治療。
    同時在兩個試驗點，豬均受到獸醫照料。在第0天進行施動物健康檢查，且記錄在健康檢查記錄表上。藉由在第0天觀察判定在接種疫苗前所有動物健康及營養狀況良好。在攻毒之前，觀察到所有試驗用動物健康及營養狀況良好。屍體及組織係藉由熬煉處理。研究動物之最後處理係記錄在動物處理記錄上。
    在第0天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×針使分派給組1-6之豬在左頸區分別接受經肌肉注射1.0毫升之PCV2疫苗1-6。利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×"針使分派給組7之豬在左頸區接受經肌肉注射2.0毫升之PCV2疫苗第7號。在第14天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×"針使分派給組7之豬在右頸區接受經肌肉注射2.0毫升之PCV2疫苗第7號。
    在第21天，所有的測試豬利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×1"針在右後腿區域接受經肌肉注射2.0毫升之KLH/ICFA。在第27天，所有測試豬利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×1"針在左後腿區域接受2.0毫升之KLH/ICFA。
    在第24天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×1"針使分派給組1-8之豬在左頸區接受經肌肉注射1.0毫升之PCV2 ISUVDL攻毒材料(5.11 log10 TCID50/mL)。利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及鼻套管將額外1.0毫升之相同材料投予每個豬(0.5 mL每一鼻孔)。
    在第-4天及自第0天至第19天每日觀察測試豬之總體健康狀況及不良事件。將觀察現象記錄在臨床觀察記錄上。自第0天至第7天觀察所有測試豬，且自第14至第21天進一步觀察組7之注射部位反應。平均日增重係藉由在第-3、24及49天，或攻毒後發現一豬死亡當天在一校準標度稱重每個豬來測定。將體重記錄在體重表上。第-3天之體重係用作在隨機選擇之前分開豬。第24天及第49天體重資料係用於測定在該等時間點每隻豬之平均日增重(ADWG)。對於在攻毒後及在第49天之前死亡之豬，校準ADWG以代表自第24天至死亡當天之ADWG。
    為了測定PCV2血清學，在第-3天及第14天自眼窩靜脈竇自每個小豬收集靜脈全血。對於每個小豬，藉由插入一無菌毛細管進入一個眼睛之內側眼角且汲極大約3.0毫升全血進入一4.0毫升血清分離管(SST)自眼窩靜脈竇收集血液。在第24，31及49天，利用一無菌18 g×1"真空采血針(Becton Dickinson and Company,Franklin Lakes,New Jersey)，一真空采血針針托及一13毫升SST自前腔靜脈收集每個豬之靜脈全血。在每個時間點之血液收集物係記錄在採樣記錄上，容許在每個SST中之血液凝結，接著將各SST旋轉減慢且採集血清，採集之血清係轉移至一無菌摁扣試管(snap tube)中且在-70±10℃下儲存直至日後測試。藉由BIVI-R&D人員測定血清樣本中是否存在PCV2抗體。
    自第20天至第49天每日一次觀察豬之臨床症狀，且將臨床觀察記錄在臨床觀察記錄上。
    為測試PCV2鼻排出，在第24，25天及接著相隔之奇數研究天數直至且包括第49天，盡可能無菌地將一無菌滌綸藥簽鼻內插入各豬之左鼻孔或者右鼻孔(每一豬一個藥簽)，向四周揮動幾秒接著移除。接著將各藥簽放入單個含有1.0毫升EMEM培養基(具有2% IFBS，500單元/毫升之青黴素，500 μg/毫升之鏈黴素及2.5 μg/mL之兩性黴素B)之無菌摁扣帽試管中。在試管中打破該藥簽，接著將摁扣試管密封且適當地貼上標籤(包括動物，研究數目，採集日期，研究天數及"鼻藥簽")。將密封的摁扣試管在-40±10℃下儲存直至在冰上隔夜轉移至BIVI-St. Joseph。將鼻藥簽採集物記錄在鼻抽汲樣品採集表上。BIVI-R&D進行定量病毒離體(VI)測試鼻抽汲樣品上之PCV2。結果係用log10值表示，認為1.3 log或更低之值為陰性，且認為任何大於1.3 log之值為陽性。
    在第一個試驗點死亡之豬(第28，52，56，69，82，及93號)係經屍體解剖至判定診斷所必需之程度。記錄大體損害，且不保留來自該等豬之任何組織。在第二試驗點，對在第49天前死亡之豬(第45，23，58，35號)及在安樂死前在第49天發現死亡之豬(第2，43號)屍體解剖。注意到任何大體損害，且具有損害之肺葉之百分比係記錄在屍體解剖報告表上。
    自在第二試驗點之103隻豬之各個屍體解剖中，將扁桃體、肺、心臟、肝臟、腸系膜淋巴結、腎及腹股溝淋巴結之組織樣本放入具有緩衝10%福爾馬林之單個容器中；而將來自上述同樣器官之另一個組織樣本放入一取樣袋(M-Tech Diagnostics Ltd.，Thelwall，UK)中且每個取樣袋係放置於冰上。將每個容器適當地貼上標籤。試樣收集係記錄在屍體解剖報告表上。此後，將經福爾馬林固定之組織樣本及一診斷申請書提交供IHC測試。IHC測試係按照用於接受樣本、樣本及載玻片製備及染色技術之標準ISU實驗方法進行。取樣袋中之新鮮的組織係用冰袋運送至研究監測處用於儲存(-70℃±10℃)及將來可能之使用。藉由病理學家檢定經福爾馬林固定之組織以藉由IHC檢測PCV2，且利用以下評分系統評分：0=沒有；1=不足之陽性染色、極少位點；2=中等陽性染色、多數位點；及3=大量陽性染色、擴散整個組織。由於病理學家不能肯定地自腸系膜LN區別腹股溝LN，將該等組織之結果簡單地貼上如淋巴結之標籤，且對每個動物之此兩個組織都給以最高評分。 結果
    如下給出此實例之結果。注意到來自組9之一個豬在第0天前死亡，且疫苗接種後又死亡5隻豬(1隻豬來自組4；1隻豬來自組6；2隻豬來自組8；及1隻豬來自組9)。死後檢驗表明6隻豬均死於與疫苗接種或PMWS不相關之潛在感染。另外，任何組都未注意到不良事件或注射部位反應。
    平均日增重(ADWG)結果係列於下表6中。組9，嚴格陰性對照組，具有最高ADWG(1.06±0.17磅/天)，接著為組5(0.94±0.22磅/天)，其接受一個劑量之8 μg之rORF2。組3，其接受一個劑量之4 μg之vORF2，具有最低ADWG(0.49±0.21磅/天)，接著為組7(0.50±0.15磅/天)，其接受2劑量之死疫苗。

    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中培養之PCV2病毒
    PCV2血清診斷結果係示於下表7中。所有9個組在第-3天對於PCV2係血清反應陰性的。在第14天，接受vORF2疫苗之組具有在187.5至529.2範圍內之最高滴度。接受死病毒疫苗之豬具有其次最高的滴度，接著為接受rORF2疫苗之豬。組8及9此時保持血清反應陰性。在第24天及第31天，接受vORF2疫苗之豬繼續表現一很強的血清學反應，緊接著為接受兩個劑量之死病毒疫苗之組。接受rORF2疫苗之豬血清學反應較慢，且組8及9繼續保持血清反應陰性。在第49天，接受vORF2疫苗、2劑量殺死病毒疫苗及最低劑量之rORF2之豬表現最強的血清學反應。接受16 μg及8 μg rORF2疫苗之豬比攻毒對照物具有略高的IFA滴度。組9在第49天表現一強血清學反應。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中培養之PCV2病毒
    *出於計算之目的，=100 IFA滴度係指定為"50"滴度，=6400 IFA滴度係指定為"12,800"滴度。
    **攻毒日期
    ***屍體解剖日期
    攻毒後之臨床觀察結果係示於下表8中。此結果概要包括對於異常行為、異常呼吸、咳嗽及腹瀉之觀察。表9包括來自臨床症狀之組總體發病率概要之結果，及表10包括來自攻毒後組死亡率概要之結果。此研究中所注明之最常見的臨床症狀為異常行為，其係經評分為輕度至嚴重之昏睡。接受2個較低劑量vORF2之豬、接受16 μg rORF2之豬及接受2個劑量KV疫苗之豬具有=27.3%之發病率。接受8 μg rORF2之豬及嚴格陰性對照組無異常行為。此研究中之豬一個也沒有表現任何異常呼吸。在所有組中都注意到了咳嗽(0至25%)，以及腹瀉(0-20%)。未注意到PMWS特異病徵性之臨床症狀。
    整個臨床症狀之發病率在組間係不同的。接受任何vORF2疫苗之組、接受16 μg rORF2之組、接受2個劑量KV疫苗之組及攻毒對照組具有最高之總體臨床症狀之發病率(=36.4%)。嚴格陰性對照組、接受8 μg rORF2之組及接受4 μg rORF2之組分別具有0%、8.3%及9.1%之總體臨床症狀發病率。
    組間之總體死亡率亦不同，接受2劑量KV疫苗之組具有最高死亡率(16.7%)；而接受4 μg vORF2、16 μg rORF2或8 μg rORF2之組及嚴格陰性對照組均具有0%死亡率。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    1各組中至少有一天表現任何異常行為之豬之總數。
    2各組中至少有一天表現任何異常呼吸之豬之總數。
    3各組中至少有一天表現咳嗽之豬之總數。
    4各組中至少有一天表現腹瀉之豬之總數。

    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    1各組中至少有一天表現任何臨床症狀之豬之總數。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中培生長之PCV2病毒
    PCV2鼻排出結果係示於下表11中。緊接著在第24天之攻毒，組7中之一個豬在第27天開始排出PCV2。直至第33天無其它組經歷排出。大量鼻排出係自第35天至第45天被注意到。接受任何3種vORF2疫苗之組及接受4或者8 μgrORF2之組具有最低的PCV2鼻排出發病率(=9.1%)。攻毒對照組(組8)具有最高排出率(80%)，接著為嚴格陰性對照組(組9)，其具有63.6%之發病率。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    黃疸之組發病率、胃潰瘍之組發病率、組平均肺損害評分及肺損害之組發病率之概要係示於下表12中。在接種疫苗後階段之研究期間，六個豬(組4，N=1；組6，N=1；組8，N=2；組9，N=2)在第一試驗點死亡。六個豬中之4個在一或多個體腔中具有纖維素性損害，一豬(組6)具有與梭狀芽胞桿菌疾病一致之損害，且一豬(組9)無大體損害。在接種疫苗後階段之研究期間死亡之豬沒有一個具有與PMWS一致之損害。
    將攻毒後死亡之豬及在第49天安樂死之豬屍體解剖。經屍體解剖，黃疸及胃潰瘍不存在於任何組中。對於平均%肺損害，組9具有最低的平均%肺損害(0%)，接著為具有0.40±0.50%之組1及具有0.68±1.15%之組5。組2、3、7及8具有最高平均%肺損害(=7.27%)。該等四個組之各組含有一具有肺損害%=71.5%之豬，其顯示該等四個組之較高的結果。除組9注意到具有0%肺損害外，剩餘8組具有=36%肺損害。幾乎所有注意到的肺損害均被描述為紅色/紫色及實變。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    組IHC陽性率結果之概要係示於表13中。組1(vORF2-16μg)及組5(rORF2-8μg)具有最低率之IHC陽性率(16.7%)。組8(攻毒對照)及組9(嚴格陰性對照)具有最高率之IHC陽性率，分別為90%及90.9%。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    攻毒後，接受一個劑量8 μg rORF2抗原之組5勝過另6個疫苗組。組5具有最高ADWG(0.94±0.22磅/天)，最低之異常行為發病率(0%)，第二最低之咳嗽發病率(8.3%)，最低總體臨床症狀之發病率(8.3%)，最低的死亡率(0%)，最低PCV2鼻排出率(8.3%)，第二最低的平均%肺損害率(0.68±1.15%)及最低的陽性組織發病率(16.7%)。接受不同量rORF2抗原之組總體勝過接受不同量vORF2之組，且接受2個劑量死全細胞PCV2疫苗之組表現最差。表14及15含有組攻毒後資料之概要。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒

    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    此研究結果表明所有進一步之疫苗努力應集中在rORF2疫苗上。在攻毒後檢測總體PCV2鼻排出，用PCV2疫苗接種導致排出降低。儘管未在組間檢測出ADWG、臨床症狀及大體損害中之大的差異，但經選擇之淋巴組織之免疫組織化學亦係用作判斷疫苗功效之優良參數。此研究因該事實變得複雜，即在研究期間將體外PCV2引入至若干點，如由PCV2鼻排出、PCV2血清轉化及在組9(嚴格陰性對照組)中之陽性IHC組織所證明。 討論
    評估此研究中之七個PCV2疫苗，包括在第0天一次投予之三個不同劑量之vORF2抗原、在第0天一次投予之三個不同劑量之rORF2抗原及在第0天及第14天投予之一個劑量之死全細胞PCV2疫苗。接受1個劑量之含有8 μg rORF2抗原之疫苗的組5總體上具有最佳結果。組5具有最高ADWG、最低異常行為發病率、最低異常呼吸發病率、第二最低的咳嗽發病率、最低總體臨床症狀之發病率、最低死亡率、最低PCV2鼻排出率、第二最低的平均%肺損害率及最低陽性IHC組織發病率。
    有趣的是，接受比組5更高劑量rORF2抗原之組4未與組5表現相當或更好。組4比組5具有略低ADWG、更高的異常行為發病率、更高的總體臨床症狀之發病率、更高的PCV2鼻排出率、更高的平均%肺損害及更高的陽性IHC組織率。未對該等資料進行統計分析(其可能已經表明該兩個組之間沒有統計學上之顯著差異)，但是觀察到組4表現不及組5之趨勢。
    接種後，在第一個試驗點6個豬死亡。六個豬中之4個係來自未接受疫苗之組8或組9。此六個豬沒有一個表現與PMWS一致之損害，未報告任何不良事件，且當投予大約11天齡之豬時，所有七個疫苗總體看上去為安全的。在接種疫苗後階段之研究期間，接受三個劑量之vORF2疫苗或死全細胞疫苗中任何一個豬具有疫苗組中最高IFAT量，而組5具有在臨攻毒前最低的IFAT量。
    儘管未正式證明，但認為離乳後不久之幼年豬之PCV2的主要傳播途徑係藉由口鼻直接接觸，且在生產套管中之降低PCV2鼻排出之有效的疫苗將幫助控制感染蔓延。接受三個vORF2抗原量中之一組及接受8 μg rORF2之組具有最低的PCV2鼻排出發病率(8.3%)。可以預料，攻毒對照組具有最高之鼻排出發病率(80%)。
    在患有PCV2感染繼發之PMWS的豬中之大體損害通常係由與一或多種以下疾病組合之全身性淋巴結病組成：(1)具有小葉間浮腫之間質性肺炎，(2)皮膚蒼白或黃疸，(3)斑點萎縮性肝臟，(4)胃潰瘍及(5)腎炎。在屍體解剖中，在任何組中未注意到黃疸、肝炎、腎炎、及胃潰瘍，且未明確地檢查淋巴結病。各組之平均%肺損害評分不同。接受16 μg vORF2抗原之組具有最低平均%肺損害評分(0.40±0.50%)，接著為接受8 μg rORF2之組(0.68±1.15%)。正如所料，攻毒對照組具有最高平均%肺損害評分(9.88±29.2%)。在所有4個組中，由於該等組中之一豬具有很高的肺損害評分，平均%肺損害評分被提高。大部分肺損害係描述為紅色/紫色及實變。通常，與PMWS相關之肺損害係描述為棕褐色的及不可折疊的小葉間浮腫。或者在此研究注意到之肺損害與PCV2感染不相關，或者可能已經存在一第二肺部傳染物。在此研究之內容中，%肺損害評分可能不反映真實量測之PCV2引起之肺感染量。
    其他研究人員已經證明在藉由IHC之PCV2抗原之存在與病理組織學之間的直接關係。此研究未進行所選擇組織之病理組織學。組1(16 μg vORF2)及組5(8 μg rORF2)具有最低的對於PCV2抗原陽性之豬發病率(8.3%)，而組9(嚴格陰性對照組-90.9%)及組8(攻毒對照組-90.0%)具有最高之對PCV2抗原陽性之豬發病率。由於此測試之非主觀性質，IHC結果可能係用於判斷疫苗功效之最佳參數之一。因此，在本發明之一態樣中，判定在面對PCV2攻毒之CDCD豬模型中最低保護劑量(MPD)含有經提取之PCV2 ORF2(rORF2)抗原及1 ml/l劑量重組產物。在接受不同量rORF2抗原之三個組中，組5(8 μg rORF2抗原)明顯地具有最高保護水平。組5或者具有最佳結果，或者與對於所有檢定參數最有利之結果相當。當組5與其它六個攻毒後之疫苗組相比時，組5具有最高ADWG(0.94±0.22磅/天)，最低異常行為發病率(0%)、第二最低的之咳嗽發病率(8.3%)、最低總體臨床症狀發病率(8.3%)、最低死亡率(0%)、最低PCV2鼻排出率(8.3%)、第二最低的平均%肺損害率(0.68±1.15%)及最低陽性IHC組織發病率(16.7%)。
    在本發明之另一態樣中，判定面對PCV2攻毒之CDCD豬模型中之最大保護劑量為1 ml/l劑量之習知產物，其係經部分純化之PCV2 ORF2(vORF2)抗原。接受不同量vORF2抗原之三個組中，組1(16 μg vORF2)具有最高防護水平。對於ADWG、平均%肺損害及IHC，組1勝過組2及3。對於整個臨床症狀發病率，組1與組2(8 μg vORF2抗原)表現相當。組3(4 μg之vORF2抗原)具有最低死亡率，且所有三個組對於鼻排出表現相當。總體上，vORF疫苗表現不及rORF疫苗。
    在本發明之又一態樣中，判定2 ml/2劑量習知殺死PCV2疫苗之最大劑量在面對PCV2攻毒之CDCD豬模型中之效能。評估此研究中之七個疫苗，死全細胞PCV2疫苗表現最差。接受兩個劑量死全細胞PCV2疫苗之小豬具有最低ADWG、第二最高的異常行為率(58.3%)、第二最高的總體臨床症狀發病率(58.3%)、最高死亡率(16.7%)、第二最高之鼻排出發生率(41.7%)、最高平均%肺損害(9.88±29.2%)，注意到之高肺損害發病率(75%)及中等之組織中IHC發病率(41.7%)。然而，其對引起免疫反應仍有效。
    在本發明之又一態樣中，將PCV2鼻排出評定為一效能參數，且再次證實來自先前研究之先前的PCV2效能參數。來自此研究之結果表明PCV2鼻排出緊接著鼻內攻毒產生，且攻毒後PCV2疫苗降低PCV2鼻排出。此外，來自此研究之結果及文獻中之報告表明應在以後之PCV2疫苗試驗中繼續對IHC評分。
    自此研究中得到的一些額外的結論為：淋巴結病為PMWS之標誌之一。PMWS之另一個標誌係淋巴衰竭及多核/巨組織細胞。另外，對於任何7個PCV2疫苗未注意到不良事件或注射部位反應，且當投予幼年豬時所有7個PCV2疫苗似乎為安全的。 實例5
    此實例測試8個PCV2候選疫苗之效能，且再次證實來自在曝露於PCV2有毒菌株後之初期攻毒研究的PCV2攻毒參數。將150個6-16天齡剖腹產取得之未餵初乳(CDCD)小豬根據重量分開且隨機分成具有相同尺寸之10組。表16闡述用於此實例之一般研究設計。

    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    給予各組之疫苗調配物係如下。以1×2毫升劑量投予組1之PCV2疫苗1號為大劑量(16 μg/2毫升劑量)之以IMS 1314輔佐之減活重組ORF2抗原(16 μg rORF2-IMS 1314)。以1×2毫升劑量投予組2之PCV2疫苗2號為大劑量(16 μg/2毫升劑量)之以Carbopol輔佐之由部分純化VIDO R-1產生之PCV2 ORF2抗原(16 μg vORF2-Carbopol)。以1×2毫升劑量投予組3之PCV2疫苗3號為大劑量(16 μg/2毫升劑量)之以Carbopol輔佐之減活重組ORF2抗原(16 μg rORF2-Carbopol)。以1×1毫升劑量投予組4之PCV2(疫苗4號為大劑量(16 μg/1毫升劑量)之以Carbopol輔佐之由部分純化VIDO R-1產生之PCV2 ORF2抗原(16 μg vORF2-Carbopol)。以1×2毫升劑量投予組5之疫苗5號為4 μg/2毫升劑量之以Carbopol輔佐之減活重組ORF2抗原(4 μg rORF2-Carbopol)。以1×2毫升劑量投予組6之PCV2疫苗6號為1 μg/2毫升劑量之以Carbopol輔佐之減活重組ORF2抗原(1 μg rORF2-Carbopol)。以1×2毫升劑量投予組7之PCV2疫苗7號為低劑量(0.25 μg/2毫升劑量)之以Carbopol輔佐之減活重組ORF2抗原(0.25 μg rORF2-Carbopol)。以1×2毫升劑量投予組8之PCV2疫苗8號為大劑量(減活前滴度>8.0 log/2毫升劑量)之以Carbopol輔佐之由減活習知死VIDO R-1所產生之PCV2 Struve抗原(>8.0 log KV-Carbopol)。在第0天，組1-8係經其所指定之疫苗處理。在第14天組1-3及5-8再次接受其各自疫苗增強。在第14天未接受增強之組4上測試單個劑量之16 μg vORF2-Carbopol之效能。觀察隨後兩次疫苗接種後小豬之不良事件及注射部位反應。在21天將小豬移至第二試驗點，其中組1-9群住在一個建築中而組10係放在一獨立建築中。在第22及28天，所有豬均接受弗氏不完全佐劑乳化之鑰孔血藍蛋白(KLH/ICFA)。在第25天，組1-9係藉由大約4 log有毒力之PCV2病毒攻毒。至第46天，在攻毒對照組中幾乎未發生死亡。為免疫刺激豬且增強PCV2攻毒材料之毒性，第46天將所有組用INGELVAC PRRSV MLV(豬繁殖及呼吸性疫苗，修飾活病毒)處理。
    收集在攻毒之前及之後之血樣用於PCV2血清診斷。收集用於測定平均日增重(ADWG)之攻毒後之體重資料及觀察之臨床徵象。在第50天，屍體解剖所有倖存的豬，記錄大體損害，病理學評分肺，且將選擇之組織保存在福爾馬林中用於日後藉由免疫組織化學(IHC)檢驗來檢測PCV2抗原。 材料及方法
    此係第0天在CDCD豬(6至16天齡)中進行之部分盲的疫苗接種-攻毒可行性研究。待包括在該研究中的是，母豬之PCV2 IFA滴度為=1:1000。另外，母豬之血清學狀況係來自已知PRRS陰性之豬群。測試了16個母豬之PCV2血清學狀況，且所有16個均具有=1000之PCV2滴度且將轉移至第一個試驗點。150個小豬係藉由剖腹產手術產生且可用於第3天之研究。在第3天，稱量在第一試驗點之150個CDCD豬，用耳標鑑別，將其藉由重量分開且隨機分派至10組之1組中，如上在表16中所述。收集所有豬的血樣。將若滿足包含標準之任何試驗用動物登記入該研究中且後來由於任何原因被排除，調查員及監視員會商討以判定在最終分析中使用自該動物所收集之資料。經登記之小豬被排除之日期及排除理由係記錄在案。滿足包含標準、經選擇用於研究且轉移至第一個試驗點之母豬沒有一個被排除。沒有小豬係由該研究中排除，且在終止之前沒有測試動物係自此研究中移除。表17描述用於此實例關鍵活動之時間框架。
    在完成該研究之有生命階段之後，藉由病理學家用免疫組織化學(IHC)檢定經福爾馬林固定之組織用於檢測PCV2抗原，對血樣進行評估用於PCV2血清診斷，自第25天至第50天測定平均日增重(ADWG)。
    在第一個試驗點，動物係關在七個房間中之單獨的籠中自出生至大約11天齡(大約為研究之第0天)。每個房間在布局上相同，且係由堆疊之單個不銹鋼籠組成，該等籠係經加熱及過濾之空氣單獨地供應給各獨立單元。每個房間具有獨立的供暖及通風設備，藉此防止房間之間空氣之交叉污染。在第二個試驗點將動物放入兩個不同建築中。將組10(嚴格陰性對照組)單獨地放在一改裝完工建築中而組1-9係放在改裝哺育建築中。將每個組放入獨立的圍欄(每一圍欄14-15隻豬)中且各圍欄為每隻豬提供大約2.3平方英尺。將組2、4及8圍在通道一邊三個相鄰的圍欄中而組1、3、5、6、7及9圍在通道另一邊六個相鄰的圍欄中。組分離係由於研究監視人員擔心投予組2、4及8之疫苗未經充分減活。各圍欄放在架高之具有塑料漏縫地板之甲板上。圍欄下的坑洞係充當排泄物及廢物之儲料槽。各建築具有其自身獨立的供暖及通風系統，幾乎不可能存在建築之間的交叉污染。
    在第一個試驗點，自出生至大約3週齡喂給小豬一經特殊調配之乳定糧。至第21天所有的小豬均吃固體經特殊混合之定糧(大約週齡)。在第二試驗點，隨意喂給所有小豬一適合於其年齡及體重之常規非用藥之商業混合之定糧。在兩試驗點亦可隨意得到水。
    在第19、20及21天，對所有測試豬在兩個後腿上輪流經肌肉注射1.0毫升NAXCEL。另外，將豬第11號((組1)在第10天經肌肉注射0.5毫升NAXCEL，對豬第13號(組10)在第10天施以1毫升青黴素及1毫升PREDEF2X，將豬第4號(組9)在第11天經肌肉注射1.0毫升NAXCEL，且由於不同健康原因，對豬1(組1)、4及11在第14天施以1.0毫升NAXCEL。
    同時在兩個試驗點，豬均受到獸醫照料。在第-3天進行動物健康檢查，且將其記錄在健康檢查記錄表上。在第0天藉由觀察判定在接種疫苗前所有動物健康及營養狀況良好。在攻毒之前，觀察到所有試驗用動物健康及營養狀況良好。將屍體及組織藉由熬煉處理。將研究動物之最後處理記錄在動物處理記錄上。
    在第0及14天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×"針使分派給組1-3及5-8之豬在右頸區及左頸區分別接受經肌肉注射2.0毫升之指定之PCV2疫苗1-4。僅在第0天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌20 g×"針使分派給組4之豬在右頸區接受經肌肉注射1.0毫升PCV2疫苗2號。
    在第22天利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×1"針使所有測試豬在左頸區接受經肌肉注射2.0毫升KLH/ICFA。在第28天利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×1"針使所有的測試豬在右後腿區接受經肌肉注射2.0毫升KLH/ICFA。
    在第25天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×l"針使分派給組1-9之豬在右頸區接受經肌肉注射1.0毫升之PCV2 ISUVDL攻毒材料(3.98 log10 TCID50/mL)。利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及鼻套管將額外1.0毫升之相同材料投予各豬中(0.5毫升每一鼻孔)
    在第46天，利用一無菌3.0毫升Luer-lock注射器及一無菌的20 g×1"針使所有測試豬在右頸區接受經肌肉注射2.0毫升INGELVAC PRRS MLV。投予該PRRSV MLV係為了增強PCV2攻毒材料之毒性。
    在第-3天及自第0天至第21天每日觀察測試豬之總體健康及不良事件。對每個豬之正常或異常行為、呼吸或咳嗽進行評分。將觀察結果記錄在臨床觀察記錄上。自第0天至第7天觀察所有測試豬，且自第14至第21天進一步觀察組7之注射部位反應。平均日增重自藉由在第-3、25及50天，或攻毒之後發現一豬死亡當天以一經校準之標度稱重每個豬來測定。將體重記錄在體重表上。利用第-3天之體重以在隨機選擇之前分開豬。利用第25天及第50天體重資料以測定在該等時間點每隻豬之平均日增重(ADWG)。對於在攻毒之後及在第50天之前死亡之豬，校準ADWG以表示自第25天至死亡當天之ADWG。
    為了測定PCV2血清診斷，在第-3天及第14天自眼窩靜脈竇自每個小豬收集靜脈全血。對於每個小豬，藉由插入一無菌毛細管進入一眼睛之內側眼角且汲極大約3.0毫升全血進入一4.0毫升血清分離管(SST)自眼窩靜脈竇收集血液。在第25、32及50天，利用一無菌20 g×1"真空采血針(Becton Dickinson and Company,Franklin Lakes,New Jersey)，一真空采血針針托及一13毫升SST自前腔靜脈收集每個豬之靜脈全血。將在每個時間點之血液採集記錄在採樣記錄上，容許在每個SST中之血液凝結，接著將每個SST旋轉減慢且採集血清，將所採集之血清轉移至一無菌摁扣管中且在-70±10℃下儲存直至日後測試。藉由BIVI-R&D人員測定血清樣本中是否存在PCV2抗體。
    自第22天至第50天每日一次觀察豬之臨床症狀且評分正常或異常行為、呼吸或咳嗽。臨床觀察係記錄在臨床觀察記錄上。
    豬第46號(組1)及98(組9)在第一個試驗點死亡。這兩個死亡均被歸類為出血死亡，且未對這兩個豬進行屍體解剖。在第二試驗點，在攻毒之後及在第50天之前死亡的豬，及將在第50天安樂死之豬屍體解剖。注意到任何大體損害，且將具有損害之肺葉之百分比記錄在屍體解剖報告表上。
    將來自在第二試驗點之各個豬之屍體解剖中的扁桃體、肺、心臟、肝臟、腸系膜淋巴結之組織樣本放入具有緩衝10%福爾馬林之單個容器中；而將來自上述同樣器官之另一÷組織樣本放入一Whirl-pak(M-Tech Diagnostics Ltd.，Thelwall，UK)中且將各Whirl-pak放置於冰上。將各容器適當地貼上標籤。試樣收集係記錄在屍體解剖報告表上。此後，將經福爾馬林固定之組織樣本及一診斷申請書提交供IHC測試。IHC測試係按照用於接受樣本、樣本及載玻片製備及染色技術之標準實驗方法進行。Whirl-pak中之新鮮的組織係用冰袋運送至研究監視人用於儲存(-70℃±10℃)及將來可能之使用。
    由病理學家檢定經福爾馬林固定之組織以用於藉由IHC檢測PCV2，且利用以下評分系統來評分：0=沒有；1=不足之陽性染色、極少位點；2=中等陽性染色、多數位點；及3=大量的陽性染色、擴散整個組織。出於分析之目的，認為0評分為"陰性"，而認為大於0之評分為"陽性"。 結果
    如下給出此實例之結果。注意到豬第46及98號分別在第14及25天死亡。將此死亡歸類為出血死亡。豬第11號(組1)在第15天因急促呼吸而氣喘。另外，在此觀察期間所有豬的行為、呼吸及咳嗽正常，任何組都未注意到任何全身性不良事件。在第0天接種疫苗之後，未注意到注射部位反應。在第14天接種疫苗之後，組1之14個豬中之7個(50.0%)在第15天得分增至"2"分。組1之14個豬中之4個(28.6%)在第16天得分仍增至"2"分。在任一疫苗接種後並未觀察到其它組經歷注射部位反應。
    平均日增重(ADWG)結果係示於下表18。死於出血之豬第46及98號將自組結果中排除。接受一個劑量16 μg vORF2 -Carbopol之組4具有最高ADWG(1.16±0.26磅/天)，接著為組1，2，3，5，6，及10，其具有在1.07±0.23磅/天至1.11±0.26磅/天範圍之ADWG。組9具有最低的ADWG(0.88±0.29磅/天)，接著為組8及7，其分別具有0.93±0.33磅/天及0.99±0.44磅/天之ADWG。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    PVC2血清診斷結果係示於下表19中。在第-3天，所有10組全部對PCV2呈血清反應陰性。在第14天，所有10組之PCV2滴度仍很低(在50-113之範圍)。在第25天，接受該全細胞殺死病毒疫苗之組8具有最高PCV2滴度(4617)，接著為組2，其接受16 μg vORF2-Carbopol，組4，其接受單一劑量16 μg vORF2-Carbopol，及組3，其接受16 μg rORF2-Carbopol，其分別具有2507、1920及1503之滴度。在第32天(攻毒後一星期)，組1-6及組8之滴度係在2360至7619之範圍內，而組7(0.25 μg rORF2-Carbopol)、9(攻毒對照)及10(嚴格陰性對照)分別具有382、129及78之滴度。在第50天(屍體解剖之日)，所有10組均表現高PCV2滴度(=1257)。
    在第25、32及50天，接受兩個劑量之16 μg rORF2-Carbopol之組3比接受兩個劑量之16 μg rORF2-IMS 1314之組1具有更高的抗體滴度。在第25、32及50天，接受兩個劑量之16 μg vORF2之組2具有比只接收一劑量同樣疫苗之組4更高的滴度。在第25及32天，接受降低量之rORF2-Carbopol(分別為16，4，1及0.25 μg)之組3、5、6、7表現相對降低之抗體滴度。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    *出於計算目的，將=100 IFA滴度指定為"50"滴度，將=6400 IFA滴度指定為"12,800"滴度。
    **攻毒日期
    ***屍體解剖日期
    以下顯示攻毒後之臨床觀察結果。表20包括對於異常行為、異常呼吸、咳嗽及腹瀉之觀察。表21包括來自臨床症狀之組總體發病率概要之結果，及表22包括來自攻毒後組死亡率概要之結果。攻毒後異常行為、呼吸及咳嗽之發病率在接受16 μg rORF2-IMS 1314(組1)、16 μg rORF2-Carbopol(組3)、1 μg rORF2-Carbopol(組6)、0.25 μg rORF2-Carbopol(組7)之豬中以及在攻毒對照組(組9)之豬中較低。攻毒後異常行為、呼吸及咳嗽之發病率在接受16μg vORF2-Carbopol(組2)、單個劑量之16μg vORF2-Carbopol(組4)、4 μg rORF2-Carbopol(組5)、>8 log KV-Carbopol(組8)之豬中以及在嚴格陰性對照組(組10)之豬中為0。
    總體臨床症狀發病率在組間係不同的。接受16 μg vORF2-Carbopol(組2)、單一劑量之16 μg vORF2-Carbopol(組4)之豬以及在嚴格陰性對照組(組10)中之豬具有0%之發病率；接受16 μg rORF2-Carbopol(組3)以及1 μg rORF2-Carbopol(組6)之豬具有6.7%之發病率；接受16 μg rORF2-IMS 1314(組1)之豬具有7.1%之總體發病率；接受4 μg rORF2-Carbopol(組5)、0.25 μg rORF2-Carbopol(組7)、以及>8 log KV疫苗之豬具有13.3%之發病率；以及在攻毒對照組(組9)中之豬具有14.3%之發病率。
    組間之總體死亡率亦不同。接受2個劑量之KV疫苗之組8具有20.0%之最高死亡率；接著為組9(攻毒對照組)及組7(接受0.25 μg rORF2-Carbopol)，其分別具有14.3%以及13.3%之死亡率。接受一個劑量之16 μg vORF2-Carbopol之組4具有6.7%死亡率。所有其它組1、2、3、5、6及10具有0%死亡率。
    1各組中至少有一天表現任何異常行為之豬之總數。
    2各組中至少有一天表現任何異常呼吸之豬之總數。
    3各組中至少有一天表現咳嗽之豬之總數。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    1各組中至少有一天表現任何臨床症狀之豬之總數。

    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    組平均百分比肺損害及初步診斷之概要係示於下表23中。組9(攻毒對照組)具有平均值10.81±23.27%之最高百分比肺損害，接著為組7，其接受0.25 μg rORF2-Carbopol且具有平均值6.57±24.74%，組5，其接受4 μg rORF2-Carbopol且具有平均值2.88±8.88%，及組8，其接受KV疫苗且具有平均值2.01±4.98%。剩餘6個組具有0.11±0.38%至0.90±0.15%範圍內之更低平均百分比肺損害。
    肺炎之初步診斷在組間不同。接受兩個劑量之16 μg rORF2-Carbopol之組3具有13.3%之肺炎最低初步診斷。組9(攻毒對照組)具有50%之組肺炎初步診斷，接著為組10(嚴格陰性對照組)及2(接受兩個劑量之16 μg vORF2-Carbopol)，其分別具有46.7%及40%之肺炎初步診斷。
    組1、2、3、5、9及10具有0%之PCV2感染組初步診斷；而接受兩個劑量之KV疫苗之組8具有20%之最高之PCV2感染組初步診斷率。接受兩個劑量之0.25 μg rORF2-Carbopol之組7及接受一個劑量之16 μg vORF2-Carbopol之組4具有各組分別為13.3%及6.7%之PCV2感染組初步診斷。
    僅在組7之一豬中診斷(6.7%)出胃潰瘍；而其它9個組未診斷出胃潰瘍。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒
    組IHC陽性率結果之概要係示於下表24中。組1(16 μg rORF2-IMS 1314)具有最低的組IHC陽性率，有0%之豬對PCV2顯陽性，接著為組2(16 μg vORF2-Carbopol)及組4(單劑量16 μg vORF2-Carbopol)，其分別具有6.7%及13.3%之組IHC率。組9(攻毒對照組)具有最高IHC陽性率，100%之豬對PCV2顯陽性，接著為組10(嚴格陰性對照組)及組8(KV疫苗)，分別有93.3%及80%之豬對PCV2顯陽性。
    vORF2=經分離之病毒ORF2；rORF2=重組桿狀病毒表現ORF2；KV或死全細胞病毒=在適當的細胞培養物中生長之PCV2病毒 討論
    在此實例中對七個PCV2疫苗進行評估，其包括兩次投予之一大劑量(16 μg)之以IMS 1314輔佐之rORF2抗原、一次投予一組豬及兩次投予第二組豬一大劑量(16 μg)之以Carbopol輔佐之vORF2抗原、兩次投予之一大劑量(16 μg)之以Carbopol輔佐之rORF2抗原、兩次投予之一4 μg劑量之以Carbopol輔佐之rORF2抗原、兩次投予之一1 μg劑量之以Carbopol輔佐之rORF2抗原、兩次投予之一低劑量(0.25 μg)之以Carbopol輔佐之rORF2抗原、及一大劑量(>8 log)之以Carbopol輔佐之死全細胞PCV2疫苗。總體上，接受兩個劑量之16 μg rORF2-IMS 1314之組1比接受含有不同量之以Carbopol輔佐之vORF2或者rORF2抗原之疫苗的組2至7表現略好，且比接受兩個劑量之死全細胞PCV2疫苗之組8表現好很多。組1具有第三最高的ADWG(1.80±0.30磅/天)、最低異常行為發病率(0%)、最低異常呼吸發病率(0%)、咳嗽之低發病率(7.1%)、總體臨床症狀之低發病率(7.1%)，與三個其它組一樣具有最低的死亡率(0%)、第二最低的平均%肺損害率(0.15±0.34%)、第二最低的肺炎率(21.4%)以及最低的陽性IHC組織發病率(0%)。然而組1係僅有的在其中記錄到注射部位反應之組，其包括在第二次接種疫苗1天之後50%接種疫苗。投予組2至7之其它疫苗比死疫苗表現好，與投予組1之疫苗表現幾乎相同。
    接受兩個劑量之以Carbopol輔佐之死PCV2疫苗之組8具有任何疫苗組中最差的一組結果。組8具有最低ADWG(0.93±0.33磅/天)、第二最高的異常行為率(6.7%)、最高異常呼吸率(6.7%)，與其它三個組相當具有最高之臨床症狀總體發病率(13.3%)、具有所有組中最高死亡率(20%)，以及具有任何疫苗組之最高的陽性IHC率(80%)。考慮到死全細胞PCV2疫苗可能在投予組8之前未充分地減活，其可能解釋此組之差的結果。不幸的是，未能獲得確定的資料證實此種擔憂。總體上，在此實例之上下文中，習知之死PCV2疫苗未幫助降低PCV2相關之疾病。
    如上文所提及，除了以IMS 1314輔佐之疫苗外，無與測試疫苗相關之不良事件。在用IMS 1314調配之疫苗第二次接種1天後，在50.0%之豬中觀察到注射部位反應，在第二次接種2天之後在28.6%之豬中觀察到注射部位反應。在任何接受以Carpobol輔佐之疫苗的豬中未記錄到反應。包括接種以IMS 1314輔佐之疫苗的豬之進一步研究應繼續進行以仔細監視豬之注射部位反應。
    在第3天所有豬對PCV2呈血清陰性，且僅組2在第14天具有高於100之滴度。在第25天(攻毒之日)，組8具有最高PCV2抗體滴度(4619)，接著為組2(2507)。在第32天，除組7、9及10外，所有組均呈現強抗體反應。至第50天，包括組7、9及10之所有的組均呈現強抗體反應。
    後期PCV2感染以及隨後的PMWS發展之標誌之一係離乳豬生長停滯，且在嚴重狀況下，注意到重量減輕。組平均日增重係表現生長停滯或重量減輕之定量方法。在此實例中，組之間在ADWG上無大的差異。組8具有0.88±0.29磅/天之最低ADWG，而組4具有1.16±0.26磅/天之最高ADWG。在此研究之上下文中，對於未來疫苗效能所基於之ADWG上，組間並無足夠差異。
    除了重量減輕-呼吸困難、昏睡、皮膚蒼白以及時有之黃疸係與PMWS相關之臨床症狀。在此實例中，各組偶爾注意到異常行為及異常呼吸以及咳嗽。如在此研究中所證明的，此攻毒模型以及攻毒菌株未導致壓倒性的臨床症狀，其不是疫苗效能所能基於之一強參數。
    總體上，死亡率在此實例中不高，且在攻毒對照組中缺乏高死亡率從而限制疫苗效能所基於的此參數。在第46天前，組4及7之十五個豬中各有1個死亡。組9之14個豬中2個死亡，且組8之15個豬中3個死亡。由於組9(攻毒對照組)未表現出PCV2臨床症狀，且至第46天在此組中僅發生兩個死亡，在第46天投予所有豬豬呼吸性及繁殖症候群病毒(PRRSV)MLV疫苗。早期研究已使用INGELVAC PRRS MLV作為免疫刺激劑以加劇與PCV2相關之PMWS疾病，且在該等早期研究當中死亡率更高。在第46天投予PRRS疫苗之後不久發生兩個死亡。組4在第46天有一個死亡且組7在第47天有一個死亡，其可能與投予PRRS疫苗不相關。至第50天，接受兩個劑量之死疫苗之組8具有最高死亡率(20%)接著為組9(攻毒對照)及組7(0.25 μg rORF2-Carbopol)其分別具有14.3%及13.3%之死亡率。總體上，在此實例之攻毒後觀察階段末期投予PRRS疫苗至攻毒模型未顯著增加死亡率。
    在患有PCV2感染繼發性PMWS之豬中之大體損害通常係由與一或多種以下各病組合之全身性淋巴結病組成：(1)具有小葉間浮腫之間質性肺炎，(2)皮膚蒼白或黃疸，(3)斑點萎縮性肝臟，(4)胃潰瘍及(5)腎炎。在屍體解剖中(第50天)，在任何組中未注意到黃疸、肝炎及腎炎。在組7之一豬中注意到胃潰瘍，但未明確地到檢查淋巴結病。根據存在與PCV2感染一致之損害，三個組中至少有一個豬係經初步診斷為PCV2(PMWS)。接受兩個劑量之死疫苗之組8具有20% PCV2初步診斷，而組7及組4分別具有13.3%及6.7% PCV2初步診斷。在屍體解剖中各組間平均%肺損害評分不同。組1，2，3，4，6及10具有在0.11±0.38%至0.90±0.15%範圍內之低%肺損害評分。正如所料，組9(攻毒對照組)具有最高平均%肺損害評分(10.81±23.27%)。在4個組中，由於該等組中各有一至三個豬具有很高的肺損害評分，所以平均%肺損害評分被提高。肺損害為紅色/紫色及實變。通常，與PMWS相關之肺損害係描述為棕褐色的，因小葉間浮腫而不可折疊的。在此研究中所注意到之肺損害或與PCV2感染不相關或可能已經存在第二肺部傳染物。在此研究之上下文中，%肺損害評分可能不反映真實量測之PCV2引起之肺感染之量。同樣，初步診斷之肺炎亦已可能被過度使用了。列出任何具有肺損害之豬(有些小至0.10%)為初步診斷之肺炎。在此實例中，對於疫苗效能所基於之大體損害及%肺損害，組間無足夠的差異。
    IHC結果顯示組間之最大差異。組1(16 μg rORF2-IMS 1314)具有對抗PCV2抗原之最低陽性IHC結果(0%)；而組9及10具有最高陽性IHC結果，分別具有100%及93.3%之發病率。接受分別用Carbopol輔佐之16、4、1或0.25 μg之rORF2抗原之組3、5、6及7分別具有20%、20%，40%及46.7%之IHC陽性率。接受兩個劑量之用Carbopol輔佐之16 μg vORF2之組2具有6.7%之IHC陽性率，而只接收一個劑量同樣疫苗之組4具有13.3%之IHC陽性率。由於此測試之目標性質及IHC結果與預期結果相關之事實，IHC測試可能係疫苗功效所基於之最佳參數之一。
    因此，在本發明之一態樣中，測定在面對PCV2攻毒之CDCD豬模型中以Carbopol輔佐之PCV2 rORF2抗原之最低保護劑量(MPD)。組3、5、6及7各自接受兩個劑量之以Carbopol輔佐之rORF2抗原，但rORF2抗原量各組不同。組3、5、6及7各自分別接受16、4、1或0.25 μg之rORF2抗原。通常，降低rORF2抗原之量會降低PCV2抗體滴度，且增加死亡率、平均%肺損害及IHC陽性組織發病率。就接受不同量之rORF2-Carbopol之該等4個組而言，分別接受兩個劑量之16或4 μg之rORF2抗原之組3及5各自具有僅20%之IHC陽性率，且各具有類似的抗體滴度。總體上，根據IHC陽性率，兩次投予之rORF2抗原之最低的保護劑量為大約4 μg。
    在本發明之另一態樣中，評定重組(rORF2)及VIDO R-1(vORF2)PCV2抗原之抗原性。組2接受兩個劑量之16 μg vORF2且組3接受兩個劑量之16 μg rORF2。兩個疫苗均係以Carbopol輔佐。發現兩個疫苗均係安全的，且兩者都具有0%死亡率。在第25天組2具有2507之PCV2抗體滴度，而組3具有1503之PCV2抗體滴度。組3比組2具有更低平均%肺損害評分(0.11±0.38%對0.90±0.15%)，但組2比組3具有更低IHC陽性率(6.7%對20%)。總體上，兩個疫苗具有類似的抗原性，但vORF2與稍佳之IHC結果相關。
    在本發明之又一態樣中，判定兩種不同佐劑(Carbopol及IMS 1314)之適用性。組1及3兩者均接受兩個劑量之含有16 μg rORF2抗原之疫苗，但組1接受以IMS 1314輔佐之抗原而組3接受以Carbopol輔佐之抗原。兩個組具有基本上相同的ADWG，基本上相同的攻毒後臨床徵象之發病率，相同的死亡率，及基本上相同的平均%肺損害；但組1具有0%之IHC陽性率而組3具有20%之IHC陽性率。然而，在第25、32及50天，接受以Carbopol輔佐之疫苗之組3比接受以IMS 1314輔佐之疫苗之組1具有更高的IFAT PCV2滴度。總體上，儘管以IMS 1314輔佐之PCV2疫苗的確提供更佳的IHC結果，但其未壓倒性地提供更好的對抗PCV2感染之保護，且的確引起注射部位反應。儘管以Carbopol輔佐之PCV2疫苗表現幾乎與以IMS 1314輔佐之疫苗相同，但其不與任何不良事件相關。
    在本發明之又一態樣中，判定PCV2 ORF2作為1 ml,1劑量產物之可行性。在第0天，組2及4兩者均接受以Carbopol輔佐之16 μg之vORF2疫苗，而在第14天組2接受一第二劑量。組4具有比組2稍高之ADWG及較低的平均%肺損害，而組2具有在第25、32及50天之更高的IFAT PCV2滴度，及稍低之IHC陽性組織發病率。該等兩個組之所有其它結果相似。總體上，一個劑量之以Carbopol輔佐之vORF2與兩個劑量之相同疫苗表現類似。
    <110>美商百靈佳殷格翰家畜藥品公司
    <120>　PCV2免疫組合物及製備該等組合物之方法
    <130>　34816-CIP1
    <140>　094147420
    <141>　2005-12-29
    <150>　60/640,510;11/034,797
    <151>　2004-12-30;2005-01-13
    <160>　11
    <170>　PatentIn version 3.3
    <210>　1
    <211>　8
    <212>　DNA
    <213>　人工的
    <220>
    <223>　此為經修飾之Kozak’s序列
    <400>　1

    <210>　2
    <211>　6
    <212>　DNA
    <213>　人工的
    <220>
    <223>　此為重組之Eco R1序列
    <400>　2

    <210>　3
    <211>　713
    <212>　DNA
    <213>　豬環狀病毒
    <400>　3


    <210>　4
    <211>　713
    <212>　DNA
    <213>　豬環狀病毒
    <400>　4


    <210>　5
    <211>　233
    <212>　PRT
    <213>　豬環狀病毒
    <400>　5


    <210>　6
    <211>　233
    <212>　PRT
    <213>　豬環狀病毒
    <400>　6


    <210>　7
    <211>　756
    <212>　DNA
    <213>　人工的
    <220>
    <223>　此為第二型豬環狀病毒，開放讀架構2與部分來自pGEM-T-easy載體之序列。
    <400>　7

    <210>　8
    <211>　10387
    <212>　DNA
    <213>　人工的
    <220>
    <223>　此為第二型豬環狀病毒、ORF2建構，其包括桿狀病毒及pGEM T-簡單編碼序列。
    <400>　8







    <210>　9
    <211>　20
    <212>　PRT
    <213>　豬環狀病毒
    <400>　9

    <210>　10
    <211>　19
    <212>　PRT
    <213>　豬環狀病毒
    <400>　10

    <210>　11
    <211>　233
    <212>　PRT
    <213>　人工的
    <220>
    <223>此為第二型豬環狀病毒，開放讀架構2之胺基酸序列。
    <400>　11



    圖1為PCV2 ORF2重組桿狀病毒之較佳建構之示意流程圖；及
    圖2a及2b為如何製備根據本發明之組合物之示意流程圖。
    (無元件符號說明)
    权利要求:
    Claims (53)
    [1] 一種回收藉由PCV2之開放閱讀框架2表現之重組蛋白質的方法，其包含以下步驟：A)　將來自PCV2之該重組開放閱讀框架2選殖至轉移載體中；B)　將該含有該重組開放閱讀框架2之轉移載體之部分轉染至病毒中；C)　用該病毒感染在培養基中之細胞；D)　引起該病毒表現來自該開放閱讀框架2之蛋白質；E)　將細胞與該載體及該上清液分離；及F)　回收在該上清液中之該經表現之開放閱讀框架2蛋白質。
    [2] 如請求項1之方法，其中該方法進一步包括在將該開放閱讀框架選殖至該轉移載體前，擴增該來自PCV2菌株之開放閱讀框架2之步驟。
    [3] 如請求項1或2之方法，其中該重組開放閱讀框架2進一步包含選自由5' kozak序列、3' EcoR1位點及其組合組成之群的序列。
    [4] 如請求項3之方法，其中該5' Kozak序列包含SEQ ID NO: 1。
    [5] 如請求項3之方法，其中該3' EcoR1位點包含SEQ ID NO: 2。
    [6] 如請求項1或2之方法，其中該PCV2之開放閱讀框架包含SEQ ID NO: 4。
    [7] 如請求項1或2之方法，其中該重組蛋白質包含SEQ ID NO: 6。
    [8] 如請求項1或2之方法，其中該培養基包含去血清昆蟲細胞培養基。
    [9] 如請求項1或2之方法，其進一步包含以下步驟：i)　在步驟A之前，將該經擴增之開放閱讀框架2選殖至第一載體中；ii)　自該第一載體切除該開放閱讀框架2；及iii)　在步驟A中使用該經切除之開放閱讀框架2。
    [10] 如請求項1或2之方法，其中該等細胞包含SF+細胞。
    [11] 如請求項1或2之方法，其中該病毒包含桿狀病毒(baculovirus)。
    [12] 如請求項1或2之方法，其中該經轉染之部分包含SEQ ID NO: 4。
    [13] 如請求項1或2之方法，其中該開放閱讀框架2蛋白質係在用該病毒感染該等細胞至少5天之後由該上清液中回收。
    [14] 一種製備用於引起對抗PCV2免疫反應之組合物的方法，該方法包含以下步驟：i)　將一構築體轉染至病毒中，該構築體包含來自PCV2之開放閱讀框架2之重組DNA；ii)　用該經轉染之病毒感染細胞，該等細胞係在生長培養基中；iii)　使該病毒表現來自該開放閱讀框架2之重組蛋白質；iv)　回收在該上清液中之該經表現之開放閱讀框架2蛋白質；及v)　將該回收之蛋白質與適當的佐劑或其它醫藥上可接受之載劑或賦形劑組合。
    [15] 如請求項14之方法，其中該方法進一步包括自轉移載體獲得該建構之步驟。
    [16] 如請求項14或15之方法，其中該方法進一步包括在將該開放閱讀框架2選殖至該轉移載體前，擴增該來自PCV2菌株之開放閱讀框架2之步驟。
    [17] 如請求項14或15之方法，其中該重組開放閱讀框架2進一步包含選自由5' kozak序列、3' EcoR1位點及其組合組成之群的序列。
    [18] 如請求項17之方法，該5' Kozak序列包含SEQ ID NO: 1。
    [19] 如請求項17之方法，該3' EcoR1位點包含SEQ ID NO: 2。
    [20] 如請求項14或15之方法，其中該PCV2開放閱讀框架2包含SEQ ID NO: 4。
    [21] 如請求項14或15之方法，其中該重組蛋白質包含SEQ ID NO: 6。
    [22] 如請求項14或15之方法，其中該培養基包含去血清昆蟲細胞培養基。
    [23] 如請求項14或15之方法，其進一步包含以下步驟：i)　將該經擴增之開放閱讀框架2選殖至第一載體中；ii)　自該第一載體切除該開放閱讀框架2；及iii)　將該經切除之開放閱讀框架2用於選殖至該轉移載體中。
    [24] 如請求項14或15之方法，其中該等細胞包含SF+細胞。
    [25] 如請求項14或15之方法，其中該病毒包含桿狀病毒。
    [26] 如請求項14或15之方法，其中該經轉染之構築體包含SEQ ID NO: 4。
    [27] 如請求項14或15之方法，其中該開放閱讀框架2蛋白質係在用該病毒感染該等細胞至少5天之後回收。
    [28] 如請求項14或15之方法，其中該回收步驟進一步包含將該等細胞及細胞碎片與該培養基分離之步驟。
    [29] 如請求項28之方法，其中該分離步驟包括以具有在約0.45 μM至約1.0 μM尺寸範圍內之孔的過濾器過濾該等細胞、細胞碎片及生長培養基之步驟。
    [30] 如請求項14或15之方法，其中該方法進一步包括使該先前之病毒減活之步驟。
    [31] 一種回收藉由來自PCV2之開放閱讀框架2表現之蛋白質的方法，其中該方法包括以下步驟：i)　用含有該開放閱讀框架2之重組病毒載體感染在生長培養基中之細胞；ii)　引起該載體表現該蛋白質；及iii)　回收在該上清液中之該經表現之蛋白質。
    [32] 如請求項31之方法，其中該回收係在用該病毒載體感染該等細胞至少5天之後進行。
    [33] 一種藉由如請求項1至32任一項中之方法獲得之物質組合物。
    [34] 一種如請求項33之組合物之用途，其係作為藥劑。
    [35] 一種如請求項33之組合物之用途，其係用於製備預防PCV2感染之藥劑。
    [36] 一種用於製備檢測樣本中之PCV2感染之診斷套組的方法，其包含：i)　製備如請求項1至30之任一項中之重組蛋白質；ii)　及將該重組蛋白質封裝至一適當的容器中。
    [37] 如請求項36之方法，其進一步包含將使用手冊與封裝該重組蛋白質之容器包括在一起之步驟。
    [38] 一種有效用於減輕與PCV2感染相關之臨床症狀之嚴重性的免疫原組合物，其包含PCV2 ORF2蛋白質或其免疫原部分，其中該免疫原部分具有來自PCV2 ORF2蛋白質之至少10個連續胺基酸。
    [39] 如請求項38之免疫原組合物，其中該PCV2 ORF2蛋白質為：i)　包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ED NO: 11之序列的多肽；ii)　與i)之多肽至少80%同源之任何多肽；iii)　i)及/或ii)之多肽之任何免疫原部分；iv　)iii)之免疫原部分，其包含包括於SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列中的至少10個連續胺基酸；v)　藉由包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之序列的DNA編碼之多肽；vi)　藉由與v)之聚核苷酸至少80%同源之聚核苷酸編碼的任何多肽；vii)藉由v)及/或vi)之聚核苷酸編碼之多肽之任何免疫原部分；viii) vii)之免疫原部分，其中編碼該免疫原部分之聚核苷酸包含包括於SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之序列中的至少30個連續核苷酸。
    [40] 如請求項38或39之免疫原組合物，其進一步包含經減活之病毒載體及細胞培養物上清液。
    [41] 如請求項40之免疫原組合物，其中該經減活之病毒載體為編碼PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒。
    [42] 如請求項40之免疫原組合物，其中該組合物包含BEI。
    [43] 如請求項42之免疫原組合物，其中該組合物包含硫代硫酸鈉。
    [44] 如請求項39之免疫原組合物，包含由下列各物組成之群中選出的額外成份：載劑、佐劑、培養基、病毒減活劑、稀釋劑、等滲劑、免疫調節劑、抗菌素、及其組合。
    [45] 如請求項44之免疫原組合物，其中該組合物包含佐劑，較佳為Carbopol。
    [46] 如請求項45之免疫原組合物，其中該組合物包含醫藥上可接受之鹽，較佳為鹽水。
    [47] 如請求項38或39之免疫原組合物，其中該組合物包含至少0.2 mcg/ml PCV2 ORF2蛋白質。
    [48] 如請求項38或39之免疫原組合物，其中該組合物包含至少2 μg PCV2 ORF2蛋白質。
    [49] 一種容器，其包含至少一個劑量之如請求項38至47任一項中之免疫原組合物，其中一個劑量包含至少2 μg PCV2 ORF2蛋白質。
    [50] 一種容器，其包含10至250劑量之如請求項38至47任一項中之免疫原組合物，其中一個劑量包含至少2 μg PCV2 ORF2蛋白質。
    [51] 如請求項49或50之容器，其進一步包含抗微生物活性劑。
    [52] 一種套組，其包含如請求項49至51任一項中之容器及使用手冊，該手冊包括將至少一個劑量該免疫原組合物經肌肉內投予小豬以減輕與PCV2感染相關臨床症狀之嚴重性的資訊。
    [53] 如請求項52之套組，其中該使用手冊包含第二次或進一步投予至少一個劑量之該免疫原組合物的資訊，其中該第二次投藥或任何進一步投藥係超過上次投藥至少14天。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DK2460820T3|2019-07-15|
    KR101798838B1|2017-11-17|
    KR20130024978A|2013-03-08|
    JP5726395B2|2015-05-27|
    CL2010000657A1|2010-10-15|
    MY147801A|2013-01-31|
    KR20080005911A|2008-01-15|
    CN101180406A|2008-05-14|
    US20090022751A1|2009-01-22|
    TW200634152A|2006-10-01|
    CA2592735A1|2006-07-06|
    AU2005321798A1|2006-07-06|
    CL2010001146A1|2011-03-18|
    AU2005321798B2|2012-03-15|
    EP1833992A2|2007-09-19|
    EP2460817A3|2013-01-09|
    US9011872B2|2015-04-21|
    WO2006072065A2|2006-07-06|
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    CL2012002431A1|2012-12-14|
    SG192442A1|2013-08-30|
    AR051885A1|2007-02-14|
    RU2007128943A|2009-02-10|
    EP2460817A2|2012-06-06|
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    CN107602671A|2018-01-19|
    US8025888B2|2011-09-27|
    WO2006072065A3|2006-12-07|
    TW201510219A|2015-03-16|
    US7910306B2|2011-03-22|
    MX2007007983A|2007-11-09|
    TWI582231B|2017-05-11|
    KR20150085134A|2015-07-22|
    US20130101621A1|2013-04-25|
    JP2012016357A|2012-01-26|
    US7829101B2|2010-11-09|
    EP2281829A2|2011-02-09|
    CN101180406B|2013-06-19|
    EP2460816A2|2012-06-06|
    EP2460817B1|2017-03-29|
    US20090022749A1|2009-01-22|
    TWI387647B|2013-03-01|
    US20090042245A1|2009-02-12|
    BRPI0519783A2|2009-03-17|
    KR101629360B1|2016-06-13|
    MY172287A|2019-11-20|
    EP2281829A3|2011-05-04|
    CN107602671B|2021-11-16|
    EP2460816A3|2014-01-01|
    US20090022752A1|2009-01-22|
    ZA200706158B|2008-12-31|
    JP2015091264A|2015-05-14|
    PT1833992E|2015-06-05|
    EP2281829B1|2014-12-17|
    US20110274710A1|2011-11-10|
    TWI479021B|2015-04-01|
    KR20140120944A|2014-10-14|
    US7833707B2|2010-11-16|
    EP1833992B1|2015-03-04|
    SG158188A1|2010-01-29|
    CA2592735C|2017-02-14|
    US20090016992A1|2009-01-15|
    RU2435854C2|2011-12-10|
    PL2281829T3|2015-05-29|
    PL1833992T3|2015-07-31|
    JP5701191B2|2015-04-15|
    DK2460817T3|2017-07-03|
    KR20130113544A|2013-10-15|
    JP2008526212A|2008-07-24|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US2909462A|1955-12-08|1959-10-20|Bristol Myers Co|Acrylic acid polymer laxative compositions|
    US3479705A|1966-12-15|1969-11-25|Miami Brick & Stone Inc Of Mia|Molding apparatus|
    US5069901A|1988-02-03|1991-12-03|Jones Elaine V|Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection|
    AU638970B2|1989-01-23|1993-07-15|Auspharm International Limited|Vaccine composition|
    US5202430A|1990-01-16|1993-04-13|University Of Tennessee|Transmissible gastroenteritis virus genes|
    JP3187419B2|1990-05-29|2001-07-11|アメリカン・サイアナミド・カンパニー|ブタ肺炎ワクチンおよびその製造方法|
    US5565205A|1990-08-16|1996-10-15|Solvay Animal Health, Inc.|Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof|
    GB9023111D0|1990-10-24|1990-12-05|Wellcome Found|Expression system|
    US5580557A|1991-10-09|1996-12-03|Iowa State University Research Foundation, Inc.|Live, avirulent salmonella choleraesuis vaccine used for inducing an immune response in animals|
    DK0555366T3|1990-11-01|2000-08-28|Univ Iowa State Res Found Inc|Fremgangsmåde til bakteriel svækkelse og vaccine|
    US6042830A|1992-08-05|2000-03-28|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Viral agent associated with mystery swine disease|
    US5338543A|1992-02-27|1994-08-16|Ambico, Inc.|Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine|
    EP0968722B1|1994-05-10|2007-06-20|Wyeth|Improved modified live BRSV vaccine|
    US5885823A|1995-06-05|1999-03-23|Nobl Laboratories, Inc.|Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents|
    AT199022T|1996-10-09|2001-02-15|Akzo Nobel Nv|Europäische vakzinstämme des fortplanzungs- atmungs-syndromsvirus des sweins |
    US20060029617A1|1997-10-03|2006-02-09|Charreyre Catherine E|Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use|
    US6391314B1|1997-10-03|2002-05-21|Merial|Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents|
    US6368601B1|1997-10-03|2002-04-09|Merial|Porcine circovirus vaccine and diagnostics reagents|
    US7211379B2|1997-10-03|2007-05-01|Merial Sas|Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2|
    US7192594B2|1997-10-03|2007-03-20|Merial Limited|Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs|
    FR2772047B1|1997-12-05|2004-04-09|Ct Nat D Etudes Veterinaires E|Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet , applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection|
    US20040062775A1|1997-12-05|2004-04-01|Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments|Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease |
    AU764379B2|1997-12-11|2003-08-14|Merial|Postweaning multisystemic wasting syndrome virus from pigs|
    EP1064024A4|1998-03-13|2005-04-06|Univ Georgia Res Found|VACCINES AGAINST CIRCOVIRUS INFECTIONS|
    FR2781159B1|1998-07-06|2000-10-06|Merial Sas|Vaccin circovirus et parvovirus porcin|
    US6294176B1|1998-07-10|2001-09-25|Schering-Plough Veterinary Corp.|Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species|
    WO2000031275A1|1998-11-19|2000-06-02|Azwell Inc.|Phosphatase de recombinaison d'acide lysophosphatidique|
    FR2789695B1|1999-02-11|2003-03-07|Merial Sas|Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs|
    US6497883B1|1999-06-10|2002-12-24|Merial|Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine|
    US6943152B1|1999-06-10|2005-09-13|Merial|DNA vaccine-PCV|
    CA2376361A1|1999-08-19|2001-03-01|Genset S.A.|Prostate cancer-related gene 3 and biallelic markers thereof|
    US6517843B1|1999-08-31|2003-02-11|Merial|Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2|
    WO2001017556A1|1999-09-07|2001-03-15|Shionogi & Co., Ltd.|Préparations vaccinales administrables par les muqueuses|
    GB9921146D0|1999-09-07|1999-11-10|Smithkline Beecham Biolog|Novel composition|
    GB9921147D0|1999-09-07|1999-11-10|Smithkline Beecham Biolog|Novel composition|
    US6656478B1|1999-11-12|2003-12-02|Samuel D. Charles|Cross-protective salmonella vaccines|
    PT1248646E|1999-12-21|2008-03-19|Merial Sas|Composições e vacinas contendo antigénio de cryptosporidium parvum e de outro patógeno entérico|
    US6808900B2|2000-06-15|2004-10-26|Manitoba, University Of|Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof|
    WO2001096377A2|2000-06-15|2001-12-20|Purdue Research Foundation|Vaccine for congenital tremors in pigs|
    US7361352B2|2001-08-15|2008-04-22|Acambis, Inc.|Influenza immunogen and vaccine|
    US7018638B2|2000-12-19|2006-03-28|Wyeth|Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine|
    MY129765A|2000-12-19|2007-04-30|Wyeth Corp|Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine|
    JP2002247979A|2001-02-23|2002-09-03|Nippon Biologicals Inc|マレック病ワクチンおよびその製造方法|
    WO2002077210A2|2001-03-27|2002-10-03|University Of Saskatchewan|Methods to culture circovirus|
    US20030096377A1|2001-06-28|2003-05-22|Virginia Tech Intellectual Properties, Inc.|Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2|
    ES2550458T3|2001-07-02|2015-11-10|Zoetis Services Llc|Vacuna monodosis con Mycoplasma hyopneumoniae|
    US7276353B2|2001-12-12|2007-10-02|Virginia Tech Intellectual Properties, Inc.|Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof|
    US7279166B2|2001-12-12|2007-10-09|Virginia Tech Intellectual Properties, Inc.|Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof|
    US6841364B2|2002-01-22|2005-01-11|Protatek International, Inc.|Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof|
    AU2003220240A1|2002-03-13|2003-09-29|Biophysica, Inc.|Boswellin compositions enhanced with 3-beta-acety1-11-keto-beta-boswellic acid , industrial manufacture and their uses|
    US20030215455A1|2002-05-14|2003-11-20|Bailey Reynolds|Vaccine stabilizer and method of use|
    US7335362B2|2002-07-19|2008-02-26|Beth Israel Deaconess Medical Center|Methods of treating pre-eclampsia or eclampsia|
    US7223207B1|2002-09-13|2007-05-29|Simon Basyuk|Exercise and massage device|
    AU2002951692A0|2002-09-23|2002-10-17|Vital Biotech Limited|Improvements in or relating to vaccines|
    MXPA05008252A|2003-02-03|2006-05-22|Cerebus Biolog Inc|Metodos para tratar, prevenir y detectar una infeccion con helicobacter.|
    US7563449B2|2003-04-21|2009-07-21|Pfizer Inc,|Methods for reducing cattle reproductive diseases|
    CN1458167A|2003-06-02|2003-11-26|中国农业科学院哈尔滨兽医研究所|截短表达的猪圆环病毒ⅱ型衣壳蛋白抗原及其应用|
    US7335361B2|2003-06-09|2008-02-26|Animal Technology Institute Taiwan|Fusion antigen used as vaccine|
    CA2533581C|2003-07-24|2012-05-08|Merial Limited|Vaccine formulations comprising an oil-in-water emulsion|
    DK1651260T4|2003-07-25|2018-10-08|Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc|Lawsonia intracellularis of European origin and vaccines, diagnostic agents and methods for their use|
    FR2861731B1|2003-10-30|2006-02-24|Centre Nat Rech Scient|Nouvelle proteine de fixation du phosphate, compositions pharmaceutiques la contenant et ses utilisations|
    CN1942204A|2004-04-26|2007-04-04|株式会社中央疫苗研究所|用于猪呼吸病的灭活混合疫苗及其制备方法|
    CN1579553A|2004-05-18|2005-02-16|浙江大学|Ii型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用|
    US7833707B2|2004-12-30|2010-11-16|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2|
    CN101189027A|2005-01-13|2008-05-28|贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司|改良的prrs疫苗|
    US7300785B2|2005-02-03|2007-11-27|Universiteit Ghent|Culturing circular ssDNA viruses for the production of vaccines|
    US8834891B2|2005-03-14|2014-09-16|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis|
    EP1869471B1|2005-04-13|2016-06-08|Merial, Inc.|Method for porcine circovirus production|
    US7691368B2|2005-04-15|2010-04-06|Merial Limited|Vaccine formulations|
    AU2006289102C1|2005-09-09|2017-11-30|Intervet International B.V.|PCV-2 vaccine|
    US7700285B1|2005-12-29|2010-04-20|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions|
    DK1968630T5|2005-12-29|2018-08-13|Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc|MULTIVALENT PCV2 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS.|
    US20080181910A1|2005-12-29|2008-07-31|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Use of a pcv2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs|
    EP2099927A4|2006-11-22|2010-05-05|Boehringer Ingelheim Vetmed|METHODS FOR REDUCING FLAMBEES OF DISEASES ASSOCIATED WITH PORCINIC CIRCOVIRUS|
    RU2520087C2|2006-12-15|2014-06-20|Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк.|Лечение свиней с помощью антигена pcv2|
    EP1941903A1|2007-01-03|2008-07-09|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Prophylaxis and treatment of PRDC|
    EP1958644A1|2007-02-13|2008-08-20|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Prevention and treatment of sub-clinical pcvd|
    GB0712160D0|2007-06-22|2007-08-01|Univ Ghent|Methods and compositions in the treatment of procine circoviral infection|
    US20090017064A1|2007-07-10|2009-01-15|Wyeth|Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus|
    US7829274B2|2007-09-04|2010-11-09|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen|
    WO2009103037A1|2008-02-15|2009-08-20|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases|
    AR078253A1|2009-09-02|2011-10-26|Boehringer Ingelheim Vetmed|Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad|
    DK2547770T3|2010-03-16|2020-03-02|Virginia Tech Intellectual Properties Inc|Levende svækket kimær porcint circovirusvaccine|
    CN103122352B|2012-09-27|2015-02-11|华中农业大学|一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用|FR2772047B1|1997-12-05|2004-04-09|Ct Nat D Etudes Veterinaires E|Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet , applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection|
    UA95602C2|2004-12-30|2011-08-25|Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк.|Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции|
    US7833707B2|2004-12-30|2010-11-16|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2|
    ES2532861T3|2004-12-30|2015-04-01|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Composiciones inmunogénicas para PCV2 para uso en un método de prevenir una infección por PCV2|
    US8834891B2|2005-03-14|2014-09-16|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis|
    DK1968630T5|2005-12-29|2018-08-13|Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc|MULTIVALENT PCV2 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS.|
    US20080181910A1|2005-12-29|2008-07-31|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Use of a pcv2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs|
    EP2099927A4|2006-11-22|2010-05-05|Boehringer Ingelheim Vetmed|METHODS FOR REDUCING FLAMBEES OF DISEASES ASSOCIATED WITH PORCINIC CIRCOVIRUS|
    WO2008073464A2|2006-12-11|2008-06-19|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections|
    RU2520087C2|2006-12-15|2014-06-20|Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк.|Лечение свиней с помощью антигена pcv2|
    EP1941903A1|2007-01-03|2008-07-09|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Prophylaxis and treatment of PRDC|
    EP1958644A1|2007-02-13|2008-08-20|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Prevention and treatment of sub-clinical pcvd|
    US7829274B2|2007-09-04|2010-11-09|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen|
    US8138318B2|2007-09-13|2012-03-20|Abbott Laboratories|Hepatitis B pre-S2 nucleic acid|
    KR20100103535A|2007-12-31|2010-09-27|베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드|외래 아미노산 삽입물을 갖는 ｐｃｖ２ ｏｒｆ２ 바이러스 유사 입자|
    JP5613061B2|2008-01-23|2014-10-22|ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド|Ｐｃｖ２マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性組成物および前記組成物の製造方法|
    WO2009103037A1|2008-02-15|2009-08-20|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases|
    CN102119033B|2008-06-25|2015-04-08|布拉施生物技术有限责任公司|用于增强促生长素抑制素免疫原性的组合物和方法|
    MX2011005231A|2008-11-19|2011-07-29|Avi Mex S A De C V Lab|Vacuna recombinante de vector viral inactivado.|
    AR078253A1|2009-09-02|2011-10-26|Boehringer Ingelheim Vetmed|Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad|
    KR20110090711A|2010-02-04|2011-08-10|녹십자수의약품|신규한 돼지 써코바이러스 타입 2 및 그의 용도|
    AU2010357208A1|2010-07-08|2013-02-21|United Biomedical, Inc.|Designer peptide-based PCV2 vaccine|
    CN101920012B|2010-07-22|2012-12-12|普莱柯生物工程股份有限公司|利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法及其产品|
    CN102115755A|2010-10-11|2011-07-06|洛阳普莱柯生物工程有限公司|酵母表达猪圆环病毒2型orf2蛋白与亚单位疫苗|
    WO2012108840A1|2011-02-08|2012-08-16|Temasek Life Sciences Laboratory Limited|A novel expression cassette for efficient surface display of antigenic proteins|
    CN102183650A|2011-02-15|2011-09-14|武汉中博生物股份有限公司|猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒|
    EP2717923B1|2011-06-10|2017-09-27|Ionis Pharmaceuticals, Inc.|Methods for modulating kallikreinexpression|
    CN103102397A|2011-11-09|2013-05-15|韩健宝|预防和治疗pcv-2病毒的肽核酸及其制剂|
    TWI473813B|2011-12-06|2015-02-21|Sbc Virbac Ltd|豬第二型環狀病毒次單位疫苗|
    CN102517331A|2011-12-26|2012-06-27|武汉中博生物股份有限公司|一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用|
    CN103033622B|2011-12-26|2015-03-25|武汉中博生物股份有限公司|猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用|
    KR20140112508A|2012-01-13|2014-09-23|베링거잉겔하임베트메디카게엠베하|백신을 제조하기 위한 키트|
    US9474692B2|2012-01-13|2016-10-25|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Kit for the preparation of a vaccinating agent|
    ES2734374T3|2013-03-01|2019-12-05|Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc|Cuantificación de composiciones de vacuna|
    EP2991676A1|2013-04-30|2016-03-09|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Orf2 protein of pcv2 subtype afor use in cross-protection|
    US20150056248A1|2013-08-23|2015-02-26|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Porcine circovirus type 2subunit vaccine|
    JP6821429B2|2013-09-25|2021-01-27|ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー|Ｐｃｖ２ｂ分岐ワクチン組成物及び使用方法|
    CA2924228A1|2013-10-02|2015-04-09|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof|
    MX369039B|2013-12-03|2019-10-25|Intervet Int Bv|Vacuna contra el circovirus porcino tipo 2.|
    JP2014065741A|2014-01-09|2014-04-17|Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc|ブタのｐｒｄｃの治療|
    TWI577802B|2014-08-01|2017-04-11|豐茂生物科技有限公司|胞外分泌型豬環狀病毒重組外殼蛋白類病毒顆粒（ＰＣＶ２ Ｃａｐ ＶＬＰ），其製備方法及於次單位疫苗之應用|
    US9328147B2|2014-09-05|2016-05-03|Chung Yuan Christian University|Recombinant baculovirus vector and uses thereof|
    CN104388453B|2014-11-14|2017-03-22|华中农业大学|一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒及应用|
    HUE051827T2|2015-03-05|2021-03-29|Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc|Marker-rendszer, különösen baculovírus által expresszált alegység-antigénekhez|
    EP3277315A2|2015-03-30|2018-02-07|Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.|Pcv2 orf2 carrier platform|
    CA2987125A1|2015-06-16|2016-12-22|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Connecting and container system|
    BR112017027336A2|2015-06-16|2018-09-04|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|sistema de conexão e recipiente.|
    HUE048645T2|2015-06-16|2020-08-28|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Összekötõ- és tartályrendszer|
    CN105087606A|2015-09-23|2015-11-25|天津瑞普生物技术股份有限公司|猪圆环病毒2型cap抗原制备方法|
    BR112018007525A2|2015-10-16|2018-10-30|Kansas State University Research Foundation|composições imunogênicas de circovírus suíno tipo 3 e métodos de produzir e usar as mesmas|
    JP6876127B2|2016-11-03|2021-05-26|ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ|ブタパルボウイルスに対するワクチン|
    AU2017353380A1|2016-11-03|2019-06-20|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof|
    JP2020501714A|2016-12-16|2020-01-23|ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ|容器システム及び方法|
    CN107365362B|2017-07-04|2021-02-05|武汉科前生物股份有限公司|一种大规模生产高纯度猪圆环病毒orf2蛋白的方法|
    AU2018298672A1|2017-07-11|2020-02-06|Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh|Container system|
    US11077181B2|2017-08-03|2021-08-03|Intervet Inc.|Vaccine comprising a PCV2 ORF2 protein of genotype 2b|
    SG11202000940XA|2017-08-24|2020-02-27|Novo Nordisk As|Glp-1 compositions and uses thereof|
    CN107982528A|2017-10-16|2018-05-04|北京生科基因科技有限公司|Pcv2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及制备方法|
    CN112088013A|2018-03-26|2020-12-15|勃林格殷格翰动物保健美国有限公司|制备免疫原性组合物的方法|
    WO2020097226A1|2018-11-06|2020-05-14|Kansas State University Research Foundation|Compositions for improving vaccine safety and efficacy and methods of use thereof|
    AU2020256283A1|2019-04-04|2021-11-18|Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.|Porcine circovirus type 3vaccines, and production and uses thereof|
    WO2022020593A2|2020-07-24|2022-01-27|Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.|Combination porcine vaccine|
    法律状态:
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US64051004P| true| 2004-12-30|2004-12-30||
    US11/034,797|US7833707B2|2004-12-30|2005-01-13|Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2|
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